[發(fā)明專利]檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310628630.9
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103695561A
• 公開（公告）日: 2014-04-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳金頂;毛晶丹;鄧潔汝;勾紅潮;裴晶晶;姚俊庸;葉佐東
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 蘇運貞;楊曉松

1.一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于包含如下引物組和核酸檢測試紙條：

所述的引物組的核苷酸序列如下所示：

F3：5’-CGGCATGGAGAAACAGAGAA-3’；

B3:5’-CCTTCAGAGCCAGTTTGTCC-3’；

FIP:5’-Biotin-CCTGCCAACGCTTGATGGAGGGAAGAGGCACATGCCACAA-3’；

BIP:5’-AGCCATCGTGGTGGAGTACTCGAGCCTGCATTTCAGGTGAC-3’；

LoopF：5’-FITC-GACCCAAGAGCTACGACAGACTGTT-3’；

LoopB：5’-GCTCGGTGAAGTTGACATCAG-3’。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：所述的核酸檢測試紙條為通用型核酸檢測試紙條。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：包含全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置和權(quán)利要求1所述的引物組；全封閉式靶核酸擴(kuò)增物快速檢測裝置為將通用型核酸檢測試紙條置入一個掌上塑料檢測裝置內(nèi)得到。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：還包含dNTP混合物溶液、MgSO₄溶液、反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、甜菜堿溶液和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒，其特征在于：包含濃度為5U/μL的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液、濃度為8U/L的鏈置換DNA聚合酶、濃度為2.5mmol/L的dNTP混合物溶液、濃度為10mol/L的甜菜堿溶液、濃度為100mmol/L的MgSO₄溶液、濃度為10μmol/L的引物FIP、濃度為10μmol/L的引物BIP、濃度為10μmol/L的引物F3、濃度為10μmol/L的引物B3、濃度為10μmol/L的引物L(fēng)oopF和濃度為10μmol/L的引物L(fēng)oopB。

6.權(quán)利要求1～5任一項所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于包含以下步驟：

（1）配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為10⁵U/L、10倍反應(yīng)緩沖液為1倍、鏈置換DNA聚合酶為0.32U/L、dNTP混合物為0.4～0.6mmol/L、甜菜堿為0～2mol/L、MgSO₄為0～3mmol/L、FIP引物為1.6μmol/L、BIP引物為1.6μmol/L、F3引物為0.2μmol/L、B3引物為0.2μmol/L、LoopF引物為0.8μmol/L、LoopB引物為0.8μmol/L，待測樣品RNA為12ng/μL；恒溫反應(yīng)；

（2）反應(yīng)：將步驟（1）恒溫反應(yīng)后的產(chǎn)物用核酸檢測試紙條檢測，10min觀察結(jié)果；

（3）結(jié)果判讀：直接肉眼判讀；

①陰性：僅在質(zhì)控區(qū)出現(xiàn)一條紅色條帶，在檢測區(qū)內(nèi)無紅色條帶出現(xiàn)，證明所檢測的樣本沒有日本乙型腦炎病毒感染；

②陽性：出現(xiàn)兩條紅色條帶，一條位于檢測區(qū)內(nèi)，另一條位于質(zhì)控區(qū)內(nèi)，證明所檢測的樣本為日本乙型腦炎病毒感染；

③無效：質(zhì)控區(qū)和檢測區(qū)內(nèi)均無紅色條帶出現(xiàn)，表明核酸試紙條失效。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于：

步驟（1）中所述的dNTP混合物的終濃度為0.4mmol/L；

步驟（1）中所述的甜菜堿的終濃度為1.5mol/L；

步驟（1）中所述的MgSO₄的終濃度為2mmol/L；

步驟（2）中所述的恒溫反應(yīng)的時間為50～70min。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP核酸試紙條試劑盒的應(yīng)用，其特征在于：

步驟（2）中所述的恒溫反應(yīng)的條件為61℃反應(yīng)60min。