[發明專利]利用展示纖維素酶的釀酒酵母菌群發酵生產乙醇的方法

在審

• 申請號: 201310618222.5
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN104673689A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 田沈;楊秀山
• 申請（專利權）人: 首都師范大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P7/10;C12R1/865
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及微生物工程領域，具體地說，涉及一種利用展示纖維素酶的釀酒酵母菌群發酵纖維素生產乙醇的方法。

背景技術

以纖維素為原料生產燃料乙醇具有重要的經濟和社會價值，然而,纖維素酶的昂貴成本以及在纖維素水解、發酵過程中存在的技術瓶頸嚴重阻礙了燃料乙醇的發展進程。乙醇工業化生產的理想途徑是利用一種微生物在一種反應器中完成纖維素酶生產、纖維素水解以及乙醇發酵，即統合生物加工過程(Consolidated?Bioprocessing,CBP)。由于釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）具有較高的乙醇產率和較高的乙醇耐受性，從而成為理想的CBP宿主，但它不能直接利用纖維素類物質。大量研究致力于在S.cerevisiae細胞表面展示纖維素酶以賦予其降解纖維素的能力，并成功構建了一些功能性的全細胞催化劑。但目前報道的重組酵母菌株并未能取得理想的效果,生產成本并未有效降低，性能良好的酵母菌株構建及應用仍舊是個亟待解決的難題。

S.cerevisiae?Y5是近年來篩選到的具有良好乙醇發酵性能的二倍體絮凝菌株。其乙醇生產的優勢在于：絮凝性使得酵母在發酵過程中能更容易分離；相對于實驗室菌株而言，二倍體酵母具有更高的細胞生長速率以及較高的抑制劑耐受性，更有利于工業化乙醇生產。在前期的研究中，我們報道了基于S.cerevisiae?Y5構建a-凝集素展示系統及β-葡糖苷酶1的固定化。重組菌株能有效表達BGLI，同時能在以纖維二糖為唯一碳源的培養基中生長。然而，纖維素的完全降解至少需要在EG、CBH和BGL的協同作用下完成。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種利用展示纖維素酶（內切葡聚糖酶II、纖維二糖水解酶II以及β-葡糖苷酶I）的釀酒酵母菌群發酵纖維素生產乙醇的方法。

為了實現本發明目的，本發明首先提供一種釀酒酵母混合菌群，所述混合菌群包含展示有內切葡聚糖酶II（EGII）的釀酒酵母重組菌Y5/EGII、展示有纖維二糖水解酶II（CBHII）的釀酒酵母重組菌Y5/CBHII以及展示有β-葡糖苷酶I（BGLI）的釀酒酵母重組菌Y5/BGLI。

其中，所述內切葡聚糖酶II和纖維二糖水解酶II來自絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma?reesei），所述β-葡糖苷酶I來自棘孢曲霉（Aspergillus?aculeatus）。

本發明還提供所述釀酒酵母混合菌群的制備方法，以釀酒酵母Y5為受體，利用α凝集素作為錨定蛋白，分別將內切葡聚糖酶II、纖維二糖水解酶II以及β-葡糖苷酶I展示在釀酒酵母Y5的表面，將構建得到重組菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按一定比例混合即得。通過調控三種重組菌之間的混合比例來實現纖維素酶間協同作用的優化。

所述重組菌的構建包括如下步驟：

1）纖維素酶基因的擴增：所述纖維素酶基因包括內切葡聚糖酶II基因、纖維二糖水解酶II基因以及β-葡糖苷酶I基因；

2）展示載體的構建：以pYD1作為出發載體，分別構建整合有內切葡聚糖酶II基因、纖維二糖水解酶II基因以及β-葡糖苷酶I基因的展示載體；

3）釀酒酵母的轉化：整合載體pAGA1經線性化，分別與步驟2）構建得到的展示載體（例如，通過醋酸鋰轉化法）共轉化至釀酒酵母Y5中構建相應的重組菌。

本發明還提供利用所述釀酒酵母混合菌群降解纖維素發酵生產乙醇的方法。

其中，混合菌群以無定形纖維素(PASC)為唯一碳源進行纖維素生物降解，發酵生產乙醇。

優選地，重組菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI經YPG誘導48h后，按1-2:1-2:1的初始接種細胞濕重比混合。

更優選地，重組菌Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按2:1:1的初始接種細胞濕重比混合。

本發明還提供了所述釀酒酵母混合菌群在纖維素統合生物加工中的應用。

本發明的有益效果在于：

本發明基于酵母α-凝集素錨定技術，將T.reesei的EGII和CBHII以及A.aculeatus的BGLI分別展示在S.cerevisiae?Y5表面，構建新型的酵母混合菌群系統，并利用該菌群系統以無定形纖維素(PASC)為底物進行乙醇發酵生產。通過進一步優化系統中展示不同酶組分的重組菌的比例以期提高纖維素的降解效率，進而提高乙醇產率。

附圖說明