[發(fā)明專利]一種13C水稻愈傷組織制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310617358.4
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103609449A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋亞娜;王鋒;蘇軍;付艷萍
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)、同位素技術(shù)和土壤微生物分子生態(tài)學(xué)領(lǐng)域，具體提供了一種獲得用于水稻土壤微生物群落研究的¹³C水稻愈傷組織的方法。

背景技術(shù)

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化反映土壤環(huán)境狀況，是衡量土壤質(zhì)量及土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的重要指標(biāo)。在根際環(huán)境中，根系分泌物及脫落物的數(shù)量和種類直接影響微生物的數(shù)量和組成，而根系分泌物的數(shù)量和種類很大程度上是由植物種類和基因型決定的，因此不同種類植物的根際往往具有其特有的優(yōu)勢微生物群落結(jié)構(gòu)。

轉(zhuǎn)基因植物是經(jīng)過物理、化學(xué)或生物學(xué)方法將由動物、植物及微生物中分離的目的基因整合到植物組織中而被賦予某種預(yù)期性狀的基因工程植物。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，越來越多的植物被賦予新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)等。但在轉(zhuǎn)基因作物推廣提高效益的同時對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境也可能存在一些潛在影響，其中對農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成和功能的影響就是一個重要方面。

轉(zhuǎn)基因作物主要通過根系分泌物和植物殘體影響土壤微生物的群落組成。轉(zhuǎn)基因作物所含有的外源基因及其表達(dá)產(chǎn)物可通過根系分泌物和作物殘留物進入農(nóng)田土壤，與土壤微生物發(fā)生互作后可能改變土壤微生物群落的多樣性及其功能。

由于土壤微生物的復(fù)雜性及其功能冗余性和作物品種及轉(zhuǎn)入的外源基因的不同，使得國內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究結(jié)果零散不一，缺乏說服力。盡管DNA分子指紋圖譜技術(shù)大大推進了環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展，但是要從整體水平上清楚認(rèn)識復(fù)雜環(huán)境中微生物群落生理代謝過程的分子機制仍具有較大困難。在轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性的影響的研究中，同樣也存在無法有效區(qū)分轉(zhuǎn)基因作物自身和其它環(huán)境因素的影響等問題。穩(wěn)定性同位素核酸技術(shù)（DNA-based?stable?isotope?probing?DNA-SIP）則能有效克服上述難點，定向發(fā)掘復(fù)雜環(huán)境中微生物群落生理代謝功能，回收同位素標(biāo)記DNA開展環(huán)境基因組學(xué)研究，能夠研究特定條件下的微生物群落結(jié)構(gòu)及其作用。該技術(shù)的核心是獲得明確無疑的微生物標(biāo)記基因組DNA，如¹³C-DNA，再通過DGGE、克隆文庫、高通量測序等下游分析研究微生物群落結(jié)構(gòu)及功能。

若獲得了含有¹³C的水稻愈傷組織，并對其進行土壤培養(yǎng)實驗，便可快速檢測轉(zhuǎn)基因水稻組織在降解過程中對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響狀況。因此¹³C水稻愈傷組織的獲得是實現(xiàn)了利用DNA-SIP技術(shù)快速準(zhǔn)確評價轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物多樣性影響的必要條件，即首先要建立¹³C水稻愈傷組織的制備方法。該方法的建立對研究轉(zhuǎn)基因水稻土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)安全性評價具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種水稻愈傷組織制備方法，該方法能夠制備出含有一定¹³C豐度的水稻愈傷組織，以便用于轉(zhuǎn)基因水稻對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響的研究。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

其制備方法包括以下步驟：

1）水稻種子的消毒；

2）用NB培養(yǎng)基進行水稻種子愈傷的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)；

3）用NBc培養(yǎng)基進行水稻愈傷組織的繼代培養(yǎng)；

4）檢測水稻愈傷組織中的¹³C豐度。

所述的水稻愈傷組織是含有¹³C豐度的愈傷組織。

其具體步驟為：

1）取水稻種子，分別用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%乙醇、0.1%?Tween20、10%?NaClO和無菌水進行種子消毒；

2）消毒后的種子濾干后接種到NB培養(yǎng)基上，于27-29℃生化培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)10-20天，幼胚生出愈傷組織，去掉幼胚將愈傷組織轉(zhuǎn)接到NB培養(yǎng)基上繼代2-3次，每代培養(yǎng)10-20天；

3）挑取一定量愈傷組織接種到NBc培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)1-2次，每代培養(yǎng)10-20天；

4）挑取用NBc培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)后的愈傷組織，用蒸餾水洗凈愈傷組織上殘留的培養(yǎng)基，然后將愈傷組織烘干磨碎后進行¹³C穩(wěn)定性同位素豐度檢測。