[發明專利]豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法

有效

• 申請號: 201310617144.7
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103623398A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 周必英
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;C12N1/21;C12N15/74;C12N15/12;C12Q1/68;A61P33/10
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

技術領域

本發明涉及豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法。

背景技術

豬囊尾蚴病（Cysticercosis?cellulosae）又稱囊蟲病（Cysticercosis），是由豬帶絳蟲（Taenia?solium）的中絳期幼蟲寄生在人體皮下、肌肉、腦、眼等臟器引起的一種嚴重危害人類健康的人畜共患寄生蟲病，已成為全球性的公共衛生問題，我國也是豬囊尾蚴病高發國家之一，以東北、華北、西北、西南地區發病率較高，全國約有200萬～300萬囊蟲病患者，感染率為0.14%～3.20%。藥物及手術治療都有其局限性，研制疫苗防治該病已成為當前研究熱點。

TSO45W-4B和TSOL18基因是豬帶絳蟲六鉤蚴階段兩個重要的免疫原基因，被認為是最具前景的疫苗候選基因。由于宿主MHC分子的多樣性和豬帶絳蟲抗原成分的復雜性，宿主將針對抗原的多個表位產生免疫反應，使得單一抗原成分誘導宿主產生的保護性免疫應答效果往往較低，因此，多種抗原的融合，綜合各種抗原分子的協同作用，可能有助于克服單一抗原成分作為候選疫苗的不足，基于這樣的思路本研究致力于豬帶絳蟲中免疫及保護效果肯定的兩種抗原TSO45W-4B、TSOL18編碼基因的融合疫苗研制。

雙歧桿菌(Bifidobacteria,Bb)是人和哺乳動物腸道內重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫調節和營養等多種生理作用。近年來，隨著基因工程技術的發展，以Bb為載體傳遞系統，已在細菌、病毒、腫瘤等領域構建了一系列重組雙歧桿菌。而在寄生蟲領域方面，尚未見豬帶絳蟲重組Bb的報道，因此，本研究擬通過全基因合成帶有接頭的豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中，構建重組質粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，電穿孔轉化長雙歧桿菌(B.longum)，構建豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗，為豬囊尾蚴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：通過全基因合成帶有接頭的豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因，將其定向克隆到大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中，構建重組質粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，電穿孔轉化長雙歧桿菌(B.longum)，構建豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗，為豬囊尾蚴病的防治提供一種有價值的新型疫苗。

本發明的技術方案是：一種豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，包括以下步驟：（1）TSO45W-4B-TSOL18融合基因合成和引物設計：根據豬帶絳蟲TSO45W-4B和TSOL18基因序列，將TSO45W-4B和TSOL18基因片段用甘氨酸接頭（Gly4Ser）3?linker連接，通過全基因合成的方法，設計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點和保護性堿基，合成長度為789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因；

（2）重組質粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的構建及鑒定：合成基因的PCR產物與克隆載體pMD18-T在T4DNA連接酶作用下，連接，連接產物轉化至E.coli?Top10感受態細胞，冰浴，水浴，冰浴冷卻后加入LB培養液，振搖，離心，棄上清，剩余200μl混勻涂于含Amp的LB瓊脂平板上，倒置培養12～16h；挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養液中，振搖培養，提取質粒，進行PCR鑒定；然后將重組質粒pMD18-T-TSO45W-4B-TSOL18與表達載體pGEX-1λT分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，膠回收相應片段后用T4DNA連接酶16℃連接，轉化至E.coli?DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切和測序鑒定；

（3）豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的構建及鑒定

①B.longum感受態細菌的制備：將B.longum凍干粉用無菌水充分溶解后，涂布于MRS瓊脂平板上，厭氧培養24～72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于MRS液體培養中厭氧培養；然后按1:25比例接種于含蔗糖的MRS培養基中，厭氧培養24～72h；冰浴，離心，棄上清，沉淀用預冷的蔗糖清洗，再用蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉化，或者加入預冷的甘油，-80℃凍存備用；