[發明專利]豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法

有效

• 申請號: 201310617144.7
• 申請日: 2013-11-29
• 公開（公告）號: CN103623398A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 周必英
• 申請（專利權）人: 遵義醫學院
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;C12N1/21;C12N15/74;C12N15/12;C12Q1/68;A61P33/10
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 吳無懼

1.一種豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）TSO45W-4B-TSOL18融合基因合成和引物設計：根據豬帶絳蟲TSO45W-4B和TSOL18基因序列，將TSO45W-4B和TSOL18基因片段用甘氨酸接頭（Gly4Ser）3?linker連接，通過全基因合成的方法，設計全長拼接引物，在引物的兩端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點和保護性堿基，合成長度為789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因；

（2）重組質粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的構建及鑒定：合成基因的PCR產物與克隆載體pMD18-T在T4DNA連接酶作用下，連接，連接產物轉化至E.coli?Top10感受態細胞，冰浴，水浴，冰浴冷卻后加入LB培養液，振搖，離心，棄上清，剩余200μl混勻涂于含Amp的LB瓊脂平板上，倒置培養12～16h；挑取單菌落至含氨芐青霉素的LB培養液中，振搖培養，提取質粒，進行PCR鑒定；然后將重組質粒pMD18-T-TSO45W-4B-TSOL18與表達載體pGEX-1λT分別用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，膠回收相應片段后用T4DNA連接酶16℃連接，轉化至E.coli?DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆，抽提質粒，進行酶切和測序鑒定；

（3）豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的構建及鑒定

①B.longum感受態細菌的制備：將B.longum凍干粉用無菌水充分溶解后，涂布于MRS瓊脂平板上，厭氧培養24～72h，使其充分活化；挑取活化的單菌落，接種于MRS液體培養中厭氧培養；然后按1:25比例接種于含蔗糖的MRS培養基中，厭氧培養24～72h；冰浴，離心，棄上清，沉淀用預冷的蔗糖清洗，再用蔗糖緩沖液重懸；此細菌可立即用于電轉化，或者加入預冷的甘油，-80℃凍存備用；

②重組質粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18電轉化B.longum感受態細菌：取備用的重組質粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18與B.longum感受態細菌混勻，冰浴10～15min后轉移至電擊杯中，電擊完畢后立即將混合液轉入到MRS液體培養基的EP管中，厭氧培養；將菌液涂布于含氨芐青霉素的MRS瓊脂平板上，厭氧培養24～72h；

③豬帶絳蟲重組Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的鑒定：挑取上述平板中單個菌落至含氨芐青霉素的MRS培養基的EP管中，厭氧培養24～72h；將菌液離心，棄上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌體沉淀，溫浴，期間振蕩使其充分反應；抽提質粒，進行酶切、PCR和測序鑒定。

2.根據權利要求1所述的一種豬帶絳蟲TSO45W-4B-TSOL18融合基因重組雙歧桿菌疫苗制備及鑒定方法，其特征在于：步驟②中所述的電擊參數設置為：電壓1.25KV、場強12.5?KV/cm、電容25μF、電阻200Ω、轉化時間5ms。