[發明專利]一種診斷人類脊髓性肌萎縮癥的熒光定量PCR試劑盒

有效

• 申請號: 201310616780.8
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103614477A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 徐湘民;周萬軍;李亮
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州市天河廬陽專利事務所 44244
• 代理人: 胡濟元

技術領域

本發明涉及生物化學領域，具體涉及核酸的測定或檢驗方法的試劑。

背景技術

脊髓性肌萎縮癥(Spinal?Muscular?Atrophy,SMA)是一組常見的常染色體隱性遺傳病，居致死性常染色體隱性遺傳病的第二位，活產嬰兒中患者發生率為1/6000～1/10000。臨床上，SMA一般分為4種類型：Ⅰ型（又稱Werding-Hoffman?。┦亲顕乐氐膩喰?重型)，約占SMA患者的一半，發病急、進展快，一般在出生6個月之內發病，多于2歲之內死亡；SMAⅡ型為慢性嬰兒型(中間型)，通常在7～18個月內發病，大多可以存活10～20歲；SMAⅢ型（又稱Wohlfart-Kugelberg-Welander?。榍嗌倌晷?輕型)，出生18個月后才發病，病情發展緩慢，一般可存活至成年，多因呼吸肌麻痹或全身功能衰竭死亡；SMAⅣ型則為成年型(極輕型)，一般于20～30歲以后發病，主要表現為緩慢逐漸發生的上下肢近端無力和肌肉萎縮，成年期都能夠行走?？偟膩碚f，SMA為致死性疾病，神經肌肉疾病病情嚴重，目前臨床上無有效治療手段。

正常情況下，人類機體會正常表達SMN蛋白和NAIP蛋白，而維護脊髓前角細胞功能。當SMN蛋白和NAIP蛋白表達下降甚至消失后，將導致脊髓前角細胞變性，從而使個體身體軀干和四肢近端骨骼肌進行性肌無力、肌萎縮，即脊髓性肌萎縮癥(SMA)。SMA的病因是由于SMA相關基因（主要包含SMN基因和NAIP基因）缺失或突變，導致SMN蛋白和NAIP蛋白表達下降甚至消失而發病，因此通過檢測SMN基因和NAIP基因缺失或突變狀況，是SMA的主要確診方法。

人類SMA相關基因位于5號染色體長臂1區3帶2亞帶（5q13.2）上，包括脊髓運動神經元(Spinal?Motor?Neurons,SMN)基因和神經元細胞凋亡抑制蛋白(Neuronal?Apoptosis?Inhibitory?Protein,NAIP)基因。其中SMN基因全長20kb，包括9個外顯子和8個內含子，有兩個非常相似的基因拷貝，即位于端粒端的SMN1(或稱SMNt)和位于著絲粒端的SMN2(或稱SMNc)。SMN1和SMN2為兩個高度同源的倒位重復DNA序列，僅在3’端有5個堿基的差異，尤其是SMN2因第7外顯子與SMN1的單個堿基差異(c.840C>T)，導致此兩個基因拷貝所編碼的蛋白產物不同，即SMN1編碼完整而穩定的SMN功能蛋白，而SMN2主要編碼功能缺陷的截短SMN蛋白，少部分（10%-50%）編碼完整而穩定的SMN功能蛋白，在SMN1基因功能完全喪失時，SMN2基因的表達對SMN蛋白的功能具有一定的補充作用，被定義為SMA的修飾基因。NAIP基因全長70kb，包括16個外顯子和15個內含子，編碼的NAIP蛋白通過阻斷細胞信號轉導通路中的caspase-3和caspase-7的激活抑制神經細胞凋亡，NAIP蛋白功能缺失，使前角運動細胞凋亡過度，導致運動神經元受損，引起繼發性肌肉萎縮，加重SMA病情，因此NAIP基因也被定義為SMA的修飾基因。

目前的研究已經表明，SMA的病因主要是SMN基因和NAIP基因部分序列缺失：其中SMN1為決定基因，表達完整而穩定的SMN功能蛋白，SMN2作為SMA的修飾基因，所表達的具有生物活性SMN蛋白量雖然較少，但隨著其拷貝數增加會有表達量的累積效應，從而使患者的臨床癥狀有一定程度的減輕。有關NAIP基因，研究顯示其缺失(缺失范圍為外顯子5和6)與SMA病情嚴重程度相關，涉及到NAIP基因缺失的SMA病人臨床表型重，僅為單獨的SMN基因缺失而未涉及NAIP基因缺失的SMA病人則臨床表型輕。據報道，98.7%(226/229)兒童型患者存在SMN1基因缺失，其中約90%的SMA病人顯示純合SMN1外顯子7和/或8缺失。Iannaccone等報道由于基因轉化，SMN2在人群中的基因拷貝數為0-4個，而不只是2個拷貝。本課題調查了1712個中國人新生兒SMN2的拷貝數，發現中國人群中SMN2基因拷貝數不均衡是普遍的現象。據此，SMN1基因序列純合缺失導致SMN蛋白功能喪失為SMA確診指標，SMN2和NAIP基因功能狀態影響疾病臨床表型的嚴重程度。所以同時檢測SMN1、NAIP三個基因目的片段的缺失或多拷貝的數量不僅可以準確診斷SMA，并且對分析估測SMA的臨床表型十分必要。