[發明專利]一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的方法

有效

• 申請號: 201310614030.7
• 申請日: 2013-11-26
• 公開（公告）號: CN103834681A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發明（設計）人: 鄒克琴;汪德凱;胡東維;李素芳;朱誠
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

（一）技術領域

本發明涉及一種農桿菌介導的真菌遺傳轉化方法，尤其涉及一種基于根癌農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的改良方法。

（二）背景技術

稻曲菌(Ustilaginoidea?virens(Cooke)Tak)屬子囊目、麥角科、擬黑粉屬。水稻稻曲病是由稻曲菌引起的水稻真菌病害。稻曲病在歷史上對水稻的危害損失并不嚴重，但是隨著全球氣候變化和我國高產優質雜交稻大面積推廣以及水稻水肥水平的提高，稻曲病危害逐年加重。稻曲病菌不但侵染水稻，還可以侵染玉米和田間一些雜草如馬唐屬和水社黍以及野生稻。水稻發生稻曲病后，不僅降低稻谷產量及質量，而且病粒含有毒素，這種毒素能引起人畜慢性中毒，極大的影響了我國糧食高產穩產和糧食食品安全。對稻曲菌的研究也逐漸引起世界各國的重視。

近年來，隨著分子生物學向真菌學的滲透和發展，真菌的遺傳轉化也越來越受到重視。真菌基因工程是進行真菌遺傳研究的重要途徑。真菌有堅韌的細胞壁結構，迄今所建立的真菌遺傳轉化技術均有利弊。例如電轉化雖然實驗過程簡單，但需要昂貴的儀器設備，而PEG介導的原生質轉化法雖然不需要儀器，但是需要制備原生質體，制備過程大多程序繁多，最終因原生質的破裂而轉化率極低。目前，農桿菌介導轉化技術在植物上應用較為廣泛，但在真菌中的應用還不是很多，根癌農桿菌介導的轉化法近幾年在一些真菌中出現有報道，例如利用根癌農桿菌轉化了黑曲霉(Aspergillus?niger)、里氏木霉(Trichoderma?reesei)、鏈孢霉(Neurospora?crassa)、立枯絲核菌（Rhizoctonia?solani）、稻瘟菌（Magnaporthe?grisea）、大麗輪枝菌（Verticillium?dahliae）、紅曲霉(Monascus?purpureus?Went)等多種真菌。根癌農桿菌介導的轉化法因而成為真菌遺傳轉化和基因克隆的強有力工具。但是不同的真菌物種有不同的生理特性，目前真菌利用農桿菌介導的方法轉化率有待提高，轉化子的穩定性也需要提高。稻曲病是水稻上的重要病害之一，農桿菌介導稻曲菌轉化的相關研究國內外還很少見報導，2006年張震進行了根癌農桿菌介導遺傳轉化稻曲病菌的初步研究（中國水稻科學,2006,20(4):440-442），但是轉化率偏低，而且無法確定轉化子的穩定性和拷貝數。因此，有必要建立一套農桿菌介導的高轉化率的稻曲菌的遺傳轉化技術，為稻曲病菌的致病機制研究、致病相關基因克隆以及為尋求控制該病害的有效途徑奠定基礎。本發明的技術效果能夠克服上述缺陷，提供一種根癌農桿菌介導的稻曲菌高效轉基因方法，以彌補現行真菌轉基因技術轉化率普遍偏低、外源基因不穩定的缺陷。

本發明涉及的一種農桿菌介導的稻曲菌遺傳轉化方法，該方法適用于稻曲菌的各種產孢的菌種類型。通過這種方法，可以成功實現在短時間內稻曲菌的遺傳轉化。

（三）發明內容

本發明目的是提供一種農桿菌介導遺傳轉化稻曲菌的高效方法，使得在短期內可以獲得大量的轉化子，可以成功實現在短時間內稻曲真菌的遺傳轉化，為稻曲菌的致病機制研究建立良好的技術平臺。

本發明采用的技術方案是：