[發(fā)明專利]一種農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化稻曲菌的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310614030.7
• 申請日: 2013-11-26
• 公開（公告）號: CN103834681A
• 公開（公告）日: 2014-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄒克琴;汪德凱;胡東維;李素芳;朱誠
• 申請（專利權(quán)）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12N15/80
• 分類號: C12N15/80;C12N1/15;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種農(nóng)桿菌介導遺傳轉(zhuǎn)化稻曲菌的方法，其特征在于所述方法按如下步驟進行：（1）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌：將構(gòu)巢曲霉啟動子和標記基因重組到帶有潮霉素B基因的質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒，然后用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，獲得含有潮霉素B基因和標記基因的農(nóng)桿菌；（2）預誘導：將含有潮霉素B基因和標記基因的農(nóng)桿菌接種至含有卡那霉素和利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、150rpm、黑暗條件下培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5～0.8，取培養(yǎng)液離心，將沉淀用改良AIM培養(yǎng)液洗滌后再用含有終濃度150～250μmol/L乙酰丁香酮的改良AIM培養(yǎng)液稀釋至OD₆₀₀為0.1～0.3，在28℃、150rpm、黑暗條件下誘導培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.3～0.5，獲得預誘導后的農(nóng)桿菌菌液；所述改良AIM培養(yǎng)液終濃度組成為：8～12mg/L?CaCl₂·2H₂O、0.8～1.2mg/L?FeSO₄、400～600mg/L?NH₄NO₃、體積濃度0.4～0.6%glycerol、30～50mmol/L?MES、0.5～0.7g/L?MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4g/L?NaCl、1.8～2.2g/L葡萄糖、50～150mg/L?ZnSO₄·7H₂O、50～150mg/LCuSO₄·5H₂O、50～150m?g/L?H₃BO₃，50～150m?g/L?Na₂MoO₄·2H₂O和50～150mg/L?CoCl₂·6H₂O，溶劑為0.01M磷酸緩沖液，pH4.8；（3）共培養(yǎng)：將稻曲菌接種在PSA液體培養(yǎng)基中，24～28℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.7～1.0，將培養(yǎng)液用紗布過濾，濾液離心，沉淀加入PSA液體培養(yǎng)基，獲得稻曲菌孢子液，然后將稻曲菌孢子液與步驟（2）獲得的預誘導后的農(nóng)桿菌菌液以體積比1：1混合制成混合菌液，將混合菌液均勻涂布于表面鋪有濾紙、PVDF膜或硝酸纖維素膜的含乙酰丁香酮的改良AIM固體培養(yǎng)基平板上，黑暗條件下于20～24℃共培養(yǎng)36～48h，再將共培養(yǎng)后的濾紙、PVDF膜或硝酸纖維素膜剪成小片并鋪在改良的選擇培養(yǎng)基CM上26℃培養(yǎng)4～5d，獲得含有潮霉素B基因的稻曲菌；所述含乙酰丁香酮的改良AIM固體培養(yǎng)基終濃度組成為：8～12mg/LCaCl₂·2H₂O、0.8～1.2mg/L?FeSO₄、400～600mg/L?NH₄NO₃、體積濃度0.4～0.6%glycerol、30～50mmol/L?MES、0.5～0.7g/L?MgSO₄·7H₂O、0.2～0.4g/L?NaCl、1.8～2.2g/L葡萄糖、50～150mg/L?ZnSO₄·7H₂O、50～150mg/L?CuSO₄·5H₂O、50～150mg/L?H₃BO₃，50～150mg/L?Na₂MoO₄·2H₂O和50～150mg/L?CoCl₂·6H₂O、150～250μmol/L乙酰丁香酮和13～18g/L瓊脂，溶劑為0.01M磷酸緩沖液，pH7.0；所述選擇性固體培養(yǎng)基CM終濃度組成為：馬鈴薯200g/L、蔗糖20g/L、瓊脂20g/L、100μg/mL潮霉素B、400μg/mL頭孢霉素、60μg/mL鏈霉素、100μg/mL卡那霉素，溶劑為水，pH7.0。