[發明專利]一種用于天然蛋白分子分離鑒定的梯度電泳方法

有效

• 申請號: 201310613929.7
• 申請日: 2013-11-28
• 公開（公告）號: CN103675072B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 李欣;陳紅兵;周建文;高金燕;謝秀玲;吳志華;楊安樹;佟平
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種通過電泳分離天然蛋白中不同分子量相差較小的方法。

背景技術

天然蛋白質是生物體內一種極重要的高分子有機物，主要有氨基酸組成，因氨基酸的組合排列不同，導致蛋白質種類繁多，性質、功能各異。因此，對不同功能特性的蛋白質進行分離鑒定，可以有選擇的加以利用，這在醫學、食品行業中的應用開發研究中具有深遠的意義。

現有的天然蛋白分離的方法有色譜技術和電泳技術。色譜技術主要有離子交換色譜、分子排阻色譜、反相色譜、疏水作用色譜等方法，色譜技術主要根據蛋白分子的理化特性來實現分離效果的。電泳技術是Native-PAGE和非還原性Native-PAGE。電泳技術中，由于分離蛋白分子有不同的形狀、尺寸及所帶電荷，根據它們的電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，在保持天然狀態條件下達到分離的目的。但是，這些方法只對于被分離蛋白質分子的等電點、分子量大小差異較大的靈敏度高，而對于等電點、分子量大小相近等復雜的蛋白樣品的分離不適合，分辨率不高。另外，這些方法都有成本高、耗時長、污染環境等缺點。

發明內容

本發明的目的是提出一種用于天然蛋白分子分離鑒定的梯度電泳方法。

本發明是通過以下步驟來實現。

（1）配置梯度膠、堆積膠及緩沖液。

a）8~15%梯度膠溶液：40%的儲液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺（Acr）：N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）=?29:1，1.5M的?pH=8.8的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸以及10%的過硫酸銨(AP)、超純水、四甲基乙二胺(TEMED)。

b）堆積膠溶液：40%的儲液，其中丙烯酰胺中丙烯酰胺（Acr）：N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）=29:1，0.5M的pH=6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸(HCl)以及10%的過硫酸銨(AP)、超純水、四甲基乙二胺(TEMED)。

c)?上樣緩沖液：0.5M的pH=6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tris)-鹽酸、0.5%的3,3’,5,5’-四溴苯酚磺酰酞(BPB)、丙三醇、超純水。

d）電極緩沖液：0.025M三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.192M的甘氨酸(Gly)。

（2)上樣：采用凝膠電泳系統，凝膠板長度為74mm。樣品與等體積2×的上樣緩沖液混合均勻，離心1min。取10μl加入上樣孔中。

（3）電泳：電泳條件堆積膠為電壓60?V，時間30分鐘；梯度膠為電壓80V，時間120分鐘；電泳時采用常規方法冷卻，電泳溫度控制在15℃以下。

（4）混合物中不同組分蛋白質分離的判定：電泳后凝膠經染色，脫色后成像，分析蛋白分離情況。經參考純蛋白的對照，根據每個泳道里的分離的條帶，分別判定混合物中不同組分的蛋白，也可通過Quality?One軟件定量出不同組分蛋白的純度。

本發明建立了一種天然蛋白分離鑒定的電泳方法，即Native-Gradient-PAGE蛋白電泳法，實現相近的分子量和等電點的天然蛋白分子的分離，在Native-PAGE中不能很好的分離蛋白混合物，利用本發明可以高分辨率的分離各種組分。

本發明所述的Native-Gradient-PAGE蛋白電泳法是基于Native-PAGE電泳，但是，Native-PAGE電泳只有一種濃度的分離膠，而Native-Gradient-PAGE是配制不同濃度梯度的分離膠，因此在凝膠中可以形成不同尺寸大小的網狀結構，根據分離蛋白本身的尺寸、形狀及所帶電荷量達到高分辨率的分離效果。

本發明使用常規的蛋白電泳系統，凝膠中不含有β-巰基乙醇，確保混合物各蛋白組分的天然狀態；另外，整個電泳都不能加SDS，因為SDS帶大量的負電荷，會影響天然蛋白帶電荷量；并通過控制蛋白泳動速率、電泳的時間及電壓等因素，將蛋白混合物的各種天然蛋白分子進行分離。

本發明建立的Native-Gradient-PAGE蛋白電泳法，具有如下優點：所需試劑都是常規試劑，且使用常規SDS-PAGE電泳儀器就可以進行操作；電泳分離效果明顯，靈敏度高，電泳結束后，不同蛋白分子因泳動速率不同，顆粒尺寸大小不一，則處于不同的泳道位置；通過此蛋白電泳，還可以分析出天然蛋白各組分的純度。

附圖說明

附圖1為本發明Native-Gradient-PAGE?電泳分析β-乳球蛋白中的兩個亞型β-lg-A和β-lg-B。泳道1：標準蛋白β-lg-A，泳道2：標準蛋白β-lg-B，泳道3：β-乳球蛋白混合樣，每孔上樣量均為1.5μg。