[發明專利]一種利用數字PCR檢測食品中菌落總數的方法

無效

• 申請號: 201310613501.2
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103667462A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 陳愛亮;吳英;蔣小玲;呂珍珍;劉金釧;楊曙明
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于食品安全領域，涉及一種檢測食品中菌落總數的方法，特別涉及一種利用數字PCR檢測食品中菌落總數的方法。

背景技術

民以食為天，食以安為先，食品安全關系到消費者的身心健康與財產安全。食品中的致病微生物是引發食品安全問題的重要原因之一，而菌落總數是作為食品安全一個很重要的微生物指標，檢測食品中菌落總數是判斷樣品是否被人、畜糞便污染及污染程度的標志，可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，以及潛伏著食物中毒和流行病的威脅，是否對人體健康具有潛在的危險。所以各個國家都針對諸如肉、蛋、奶、飲料等各種食品中的菌落總數制定了限定標準，并依法對各種食品的微生物含量進行抽查檢測。例如我國規定醬油、巴氏殺菌乳中的菌落總數不能超過30000cfu/ml，生鮮乳中不能超過200萬cfu/ml。由于食品基質復雜，食品中微生物數量較少，目前對食品中菌落總數的檢測方法都要依賴于細菌培養，在培養的基礎上檢測，因此檢測時間需要1-2天完成。如目前的國標培養法需要48-72個小時才能完成，美國進口3M菌落總數測試片也需要48小時才能確認結果。對于講究鮮活的食品來講，檢測時間過長，大大影響了食品的供應，同時也降低了鮮活食品的質量。因此急需一種快速的食品中菌落總數的檢測方法。

數字PCR是近年來迅速發展起來的一種定量分析技術，主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統定量PCR技術不同的是數字PCR不依賴于擴增曲線的循環閾值(CT)進行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用看家基因和標準曲線，具有很好的準確度和重現性，可以實現絕對定量分析。在現階段的低豐度因子含量檢測中，定量PCR、雜交等方法都因受到背景DNA或雜質的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達不到精細定量的要求（如定量PCR檢測中Ct值大于33的情況下，其重復性和準確性就不是很高），而微滴式數字PCR檢測系統通過微滴化處理，使得稀有的待檢測片段從大量的背景DNA中分離出來，從而提高了檢測的靈敏度及精確性。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用數字PCR檢測食品中菌落總數的方法。

數字PCR方法在檢測食品中菌落總數中的應用也屬于本發明的保護范圍。

本發明所提供的利用數字PCR檢測食品中菌落總數的方法，具體可包括如下步驟：

（1）富集待測食品中的細菌，將富集物與DNA結合物共同孵育，獲得PCR擴增模板；

所述DNA結合物為不能穿過完整的細胞膜（活細菌），但能與細胞膜受損（死細菌）后暴露出來的DNA結合的物質；

（2）配制PCR反應體系，進行數字PCR反應；所述PCR反應體系中含有步驟（1）獲得的PCR擴增模板、細菌通用引物對、熒光染料、dNTP和DNA聚合酶；

（3）根據步驟（2）數字PCR反應產生的熒光信號，計算得到所述待測食品中的菌落總數。

在上述方法中，所述待測食品可為液體食品，也可為固體食品。如各種鮮活農產品及其加工食品、水以及飲料等。在本發明的一個實施例中，所述待測食品為奶，具體為牛奶，更加具體為生鮮牛乳或巴氏殺菌牛奶。

當所述待測食品為液體食品（如牛奶）時，上述方法的步驟（1）中，所述“富集待測食品中的細菌”可為將所述待測食品（如牛奶）離心，所得沉淀即為所述富集物（富集了待測食品中的細菌）。進一步，將所述待測食品（如牛奶）離心的轉速可為14000g，時間可為5-10min（如10min），溫度可為4℃。

在上述方法的步驟（1）中，將所述富集物與所述DNA結合物共同孵育的目的是為了讓所述DNA結合物與死細菌的DNA結合，從而阻斷死細菌DNA分子的PCR擴增，從而有效實現對活細菌的選擇性擴增。

在上述方法中，所述細菌通用引物對具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。

在上述方法中，所述DNA結合物具體可為疊氮溴化丙錠（PMA）或疊氮溴化乙錠（EMA）。

在上述方法中，所述熒光染料具體可為SybGreen或EvaGreen。