[發明專利]GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310611566.3
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103602695A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 左百樂;曹毓琳;栗炳南;林俊堂;豐慧根;連杰
• 申請（專利權）人: 河南省華隆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 潘雯瑛;秦雪梅

技術領域

本發明涉及一種重組載體及其制備方法和應用，特別是涉及一種雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用。

背景技術

黑色素瘤（Melanoma），又稱惡性黑色素瘤（Malignant?Melanoma，MM），是來源于神經嵴黑色素細胞的惡性腫瘤，多發生于皮膚體表，亦可見于脈絡膜、軟腦膜及消化道等，其惡性程度高，是體表腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。近年來，黑色素瘤的發病率及相應的死亡率在迅速增長，且發病年齡愈來愈早，嚴重威脅著人類的健康。

黑色素瘤的傳統治療，是包括手術、化療、免疫治療等在內的綜合治療。目前唯一有效的治療方法是在腫瘤厚度小于1毫米時通過手術切除腫瘤，但由于黑色素瘤的高度侵襲轉移性和對多種化療藥物的耐藥性，導致其療效不佳以及預后不良。針對腫瘤患者普遍存在免疫力低下的情況，通過免疫治療來誘導機體的特異性抗腫瘤免疫反應，以抑制腫瘤的生長、轉移及復發。近年來，攜帶外源特異性腫瘤抗原的疫苗已成為腫瘤免疫治療的新方向，包括基因疫苗、腫瘤細胞疫苗、細菌疫苗、病毒疫苗及樹突狀細胞疫苗等。其中，基因疫苗是通過特定載體將具有治療作用的基因導入細胞的治療方法；然而，基因治療只能短時間提高某種基因對應蛋白表達水平，其療效持續時間短，缺乏長期抗腫瘤能力。

腫瘤之所以能在體內增殖、轉移，是因為缺少MHC抗原等能激活T細胞的分子，因而不能被T細胞識別，無法激活T細胞介導的主動免疫。因此，要誘導強有力的抗腫瘤免疫應答，不僅需要腫瘤相關抗原的表達和呈遞，還需要增強共刺激分子和細胞因子介導的免疫作用。

粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage?Colony?Stimulating?Factor，GM-CSF）是一種重要的免疫調節分子，它不僅可誘導在T細胞免疫反應中起關鍵作用的DC細胞成熟、分化，而且在免疫治療過程中可增強主要和次要的抗體反應，以促進DC等APC分化、成熟和活化以及上調協同刺激分子（如CD86）的表達水平，增強中性粒細胞、單核巨噬細胞、嗜酸性粒細胞對腫瘤細胞的吞噬作用和ADCC效應等活性，促進Th、Tc、NK細胞在腫瘤部位浸潤，抑制腫瘤細胞的生長。GM-CSF目前已被廣泛應用于腫瘤的免疫治療，GM-CSF以其顯著的免疫調節作用和低毒性，成為腫瘤疫苗重要的免疫佐劑，GM-CSF還可作為化療的輔助用藥，提升腫瘤患者外周血白細胞水平（主要為粒細胞與單核細胞數量）的同時，誘導機體的免疫系統活化，加強對腫瘤的免疫；除上述生物學效應外，GM-CSF還能增加腫瘤基質分泌血管生成抑制素，抑制腫瘤的血管生成和轉移；轉染GM-CSF基因的腫瘤疫苗在黑色素瘤的免疫治療研究中取得了顯著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治療方法只是局部地提高機體的GM-CSF蛋白表達水平，其免疫調節作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。

MART-1（人黑色素瘤分化抗原）是黑素瘤分化的相關抗原，其參與黑素小體成熟，表達于黑素瘤和黑素瘤細胞系，在多數類固醇腫瘤（包括腎上腺皮質腫瘤）、黑色素細胞病變以及血管周細胞瘤中表達。MART-1有較強的免疫原性，易于被細胞毒性T淋巴細胞（CTL）識別，產生有效的抗腫瘤免疫應答，被認為是黑素瘤免疫治療的最佳候選者。

發明內容

基于此，有必要針對現有技術存在的缺陷，提供一種GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體，該重組載體可用于黑色素瘤的基因免疫治療，既能發揮細胞因子的免疫調節作用，又能靶向性地針對黑色素瘤產生特異性抗腫瘤效應。

本發明的另一個目的是，提供所述GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法。

本發明的再一個目的是，提供所述GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體在黑色素瘤免疫治療中的應用。

GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

在其中一個實施例中，所述的載體為pIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2-GM-CSF-MART-1重組載體；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。