[發明專利]GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310611566.3
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103602695A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 左百樂;曹毓琳;栗炳南;林俊堂;豐慧根;連杰
• 申請（專利權）人: 河南省華隆生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 潘雯瑛;秦雪梅

1.GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體，其沿載體轉錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；

所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。

2.根據權利要求1所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體，其特征在于：所述的載體為pIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2-GM-CSF-MART-1重組載體；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。

3.根據權利要求1所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體，其特征在于：所述的載體為pIRES2-EGFP質粒載體，所述的雙基因共表達重組載體為pIRES2-MART-1-GM-CSF重組載體；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。

4.權利要求1所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟：

1）獲得含有特異性酶切位點的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段；

2）將步驟1）得到的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段連接于載體，構建含有GM-CSF基因或MART-1基因的重組載體；

3）獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段；

4）將步驟3）得到的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段連接于步驟2）得到的重組載體，構建所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體。

5.權利要求2所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達重組載體的制備方法，包括以下步驟：

A）獲得含有特異性酶切位點的GM-CSF基因片段：從CIK細胞獲取cDNA作為模板，用含有EcoR?I和BamH?I酶切位點序列的GM-CSF特異性引物進行PCR擴增，得到含有EcoR?I和BamH?I酶切位點的GM-CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:6所示；

B）構建pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體：用限制性內切酶EcoR?I、BamH?I分別酶切pIRES2-EGFP質粒以及步驟A）得到的GM-CSF基因片段，并采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體；

C）獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段：從黑色素瘤細胞A375獲取cDNA作為模板，用含有BstX?I和Not?I酶切粘性末端的MART-1特異性引物進行PCR擴增，所得到的PCR反應產物再進行雜交PCR反應，得到MART-1基因片段混合物，其中的一種MART-1基因片段具有BstX?I和Not?I酶切粘性末端；

D）構建pIRES2-GM-CSF-MART-1重組載體：用限制性內切酶BstX?I、Not?I酶切步驟B）得到的pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體，將步驟C）得到的MART-1基因片段混合物與酶切后線性化的pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進行連接反應，得到pIRES2-GM-CSF-MART-1重組載體。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟A）所述的GM-CSF特異性引物為：

GM-CSF上游引物：5’-CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3’，

GM-CSF下游引物：5’-TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3’。