[發明專利]一種單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的方法

有效

• 申請號: 201310609297.7
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103614359A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 林日輝;韋成昱;黃文勤
• 申請（專利權）人: 南寧奕德環境科技有限公司
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，具體來講涉及一種單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的方法，包括重組草酸脫羧酶的制備、單甲氧基聚乙二醇（mPEG）的活化、草酸脫羧酶的修飾等工藝。?

背景技術

草酸以草酸鹽的形式廣泛的分布在植物、微生物和人在內的生物體內。人體內沒有降解草酸鹽的相關酶，人們在食用某些高草酸含量的食物如菠菜，莧菜，草莓，橘子，李子，花生醬，高粱和茶葉等會容易造成草酸鹽在人體內積累，從而引發如尿結石、腎結石、高草酸尿、低血鈣癥等多種病理狀態。董婷婷等在2011年《中國微生態學》雜志的《利用乳酸菌降解草酸預防結石的研究進展》文中提出泌尿性系統結石病嚴重影響著人類的健康，根據地理環境的不同其發病率在3%～15%，而且還呈上升到趨勢，結石病治療后易復發，治愈后復發率高達60%～80%。Fredric?L.?Coe等對部分病人的結石成分進行分析，發現難溶的草酸鈣高達80%，可見草酸鹽是導致結石癥的重要原因。目前對高草酸鹽水平引起結石癥的治療方法都不是非常理想，主要通過限制草酸的攝入量來預防結石，而且許多原發性的高草酸尿患者需要密集的透析和器官移植，這大大增加了患者的痛苦和經濟壓力，因此需要尋求一種安全的從體內去除草酸鹽的方法。通過服用某種酶制劑降解攝入體內的草酸鹽，是緩解泌尿性系統草酸鹽結石病癥，降低患者痛苦的有效方法。

草酸脫羧酶(EC?4.1.1.2)?催化轉化草酸為甲酸和CO₂，是生物體內催化降解草酸及草酸鹽的主要催化酶之一，對底物草酸具有較強的專一性。草酸脫羧酶主要存在于木材腐敗真菌中，如漆斑菌(Myrothecium?Verrucari)、金針菇(Flammulina?velutipes)、黑曲霉(Aspergillus?niger)、雙孢蘑菇（Agaricus?bisporus）等，細菌中枯草桿菌(Bacillus?subtilis)的草酸脫羧酶研究報道較多。草酸脫羧酶在醫療、食品、工業生產和生物監測等領域都有非常大的應用潛力。針對草酸鹽結晶引起的結石癥，目前已有一些使用草酸脫羧酶進行預防與治療的研究報道。Patrick?W.?Mufarrij利用體外實驗設置不同pH以模擬消化道環境，研究了草酸脫羧酶制劑Oxazyme對菠菜中草酸的降解能力。Grujic?D等使用基因敲除小鼠為模型，通過口服交聯草酸脫羧酶晶體?(OxDc-CLEC)，使尿草酸及糞草酸分別降低44%和72%。研究表明，使用草酸脫羧酶可以有效的降解動物消化道中草酸，對防止了腎鈣質沉著癥及尿石癥的發生具有良好效果。然而，酶作為一種蛋白質，也存在容易受環境因素作用而變性失活的問題。草酸脫羧酶用于消化道內草酸降解時，將經受胃酸，蛋白酶消化的影響，容易被消化而失去其活性。為了改善草酸脫羧酶的使用性能，對其進行化學修飾是一種有效手段。

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發明內容

在上述背景下，本發明提供一種可以解決目前草酸脫羧酶使用中受胃酸，蛋白酶消化的影響，容易被消化而失去其活性的現實問題，具體提供了一種單甲氧基聚乙二醇修飾改善草酸脫羧酶性能的方法。經修飾后，草酸脫羧酶的熱穩定性、pH適應性、耐熱性及對胰蛋白酶的耐受性都有所增強。可用于制備預防和治療草酸鹽結晶引起結石病的酶制劑。

本發明采用如下技術制取本發明的技術方案：一種單甲氧基聚乙二醇修飾改善草酸脫羧酶性能的方法。包括重組草酸脫羧酶的制備，單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備兩部分。工藝步驟如下：

（1）重組草酸脫羧酶的制備

將產草酸脫羧酶基因工程菌E．coli?BL21(DE3)/pET32a/YvrK進行發酵培養。當細菌生長至OD600為0.8時，加入MnCl₂及IPTG誘導草酸脫羧酶表達，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進行超聲破碎細菌，離心收集上清為粗酶液。

使用AKTA-FPLC系統進行酶純化。粗酶液過0.2μm孔徑膜后上柱?(5?mL?HisTraP?HP離子交換色譜柱)，調節洗脫液中咪唑濃度進行洗脫，將草酸脫羧酶與其他雜質分離。分級分離酶液經超濾濃縮、脫鹽，獲得純化的草酸脫羧酶。

（2）單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備