[發明專利]一種單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的方法

有效

• 申請號: 201310609297.7
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103614359A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 林日輝;韋成昱;黃文勤
• 申請（專利權）人: 南寧奕德環境科技有限公司
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/88;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所(普通合伙) 44248
• 代理人: 胡吉科

1.一種單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：?包括如下步驟：

（1）單甲氧基聚乙二醇的活化：將mPEG5000溶解于氯仿，加入醋酸酐，并加入經干燥處理后的二甲基亞砜（DMSO），室溫下攪拌反應3～12h后，將反應溶液逐滴加入4倍體積的冰乙醚，高速攪拌，過濾收集沉淀并用氯仿重溶，使用冰乙醚再次沉淀，重復2～3次，將沉淀于室溫真空干燥24h，即可獲得活化的單甲氧基聚乙二醇,即mPEG-醛；

（2）修飾重組草酸脫羧酶：將mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按10:1～150:1的摩爾比置于4～45℃和pH4～9條件下攪拌反應2-24h，加入過量甘氨酸終止反應，將反應產物裝入8000-14000的透析袋，先使用磷酸鹽緩沖液透析除去甘氨酸、殘余單甲氧基聚乙二醇等雜質，然后進行濃縮處理。

2.根據權利要求1所述的單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（1）中加入的醋酸酐與mPEG摩爾比為10:1～30:1。

3.?根據權利要求1所述的單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（2）中使用磷酸鹽緩沖液透析除去甘氨酸、殘余單甲氧基聚乙二醇等雜質后用30%w/v的PEG20000溶液進行濃縮處理。

4.一種如權利要求1中所述的重組草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）將產草酸脫羧酶基因工程菌E.?coli?BL21(?DE3)?/pET32a/YvrK

進行發酵培養，細菌生長后，誘導草酸脫羧酶表達，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進行超聲破碎細菌，離心收集上清為粗酶液；

（2）進行酶純化，粗酶液過0.2μm孔徑膜后上柱，洗脫，將草酸脫羧酶與其他雜質分離，分級分離酶液經超濾濃縮、脫鹽，獲得純化的草酸脫羧酶。

5.根據權利要求2所述的重組草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（1）中當細菌生長至OD600為0.8時，加入MnCl₂及IPTG誘導草酸脫羧酶表達。

6.根據權利要求2所述的重組草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（2）中所述進行酶純化所用系統為AKTA-FPLC系統。