[發(fā)明專利]一種單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310609297.7 | 申請日： | 2013-11-27 |
| 公開（公告）號： | CN103614359A | 公開（公告）日： | 2014-03-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 林日輝;韋成昱;黃文勤 | 申請（專利權(quán)）人： | 南寧奕德環(huán)境科技有限公司 |
| 主分類號： | C12N9/96 | 分類號： | C12N9/96;C12N9/88;C12R1/19 |
| 代理公司： | 深圳市科吉華烽知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙) 44248 | 代理人： | 胡吉科 |
| 地址： | 530007 廣西壯族自治區(qū)南寧市總部路*** | 國省代碼： | 廣西;45 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 單甲氧基 聚乙二醇 修飾 草酸 脫羧酶 方法 | ||
1.一種單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：?包括如下步驟：
（1）單甲氧基聚乙二醇的活化：將mPEG5000溶解于氯仿，加入醋酸酐，并加入經(jīng)干燥處理后的二甲基亞砜（DMSO），室溫下攪拌反應(yīng)3～12h后，將反應(yīng)溶液逐滴加入4倍體積的冰乙醚，高速攪拌，過濾收集沉淀并用氯仿重溶，使用冰乙醚再次沉淀，重復(fù)2～3次，將沉淀于室溫真空干燥24h，即可獲得活化的單甲氧基聚乙二醇,即mPEG-醛；
（2）修飾重組草酸脫羧酶：將mPEG5000-醛和Oxdc酶蛋白按10:1～150:1的摩爾比置于4～45℃和pH4～9條件下攪拌反應(yīng)2-24h，加入過量甘氨酸終止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物裝入8000-14000的透析袋，先使用磷酸鹽緩沖液透析除去甘氨酸、殘余單甲氧基聚乙二醇等雜質(zhì)，然后進行濃縮處理。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（1）中加入的醋酸酐與mPEG摩爾比為10:1～30:1。
3.?根據(jù)權(quán)利要求1所述的單甲氧基聚乙二醇修飾草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（2）中使用磷酸鹽緩沖液透析除去甘氨酸、殘余單甲氧基聚乙二醇等雜質(zhì)后用30%w/v的PEG20000溶液進行濃縮處理。
4.一種如權(quán)利要求1中所述的重組草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：
（1）將產(chǎn)草酸脫羧酶基因工程菌E.?coli?BL21(?DE3)?/pET32a/YvrK
進行發(fā)酵培養(yǎng)，細菌生長后，誘導(dǎo)草酸脫羧酶表達，離心收集菌體，磷酸鹽緩沖液重懸菌體后進行超聲破碎細菌，離心收集上清為粗酶液；
（2）進行酶純化，粗酶液過0.2μm孔徑膜后上柱，洗脫，將草酸脫羧酶與其他雜質(zhì)分離，分級分離酶液經(jīng)超濾濃縮、脫鹽，獲得純化的草酸脫羧酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（1）中當(dāng)細菌生長至OD600為0.8時，加入MnCl2及IPTG誘導(dǎo)草酸脫羧酶表達。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組草酸脫羧酶的制備方法，其特征在于：步驟（2）中所述進行酶純化所用系統(tǒng)為AKTA-FPLC系統(tǒng)。
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