[發(fā)明專利]一種EPO突變體的毛細管電泳檢測方法

在審

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• 申請日: 2013-11-26
• 公開（公告）號: CN104677971A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發(fā)明（設計）人: 金榮;王芳;單劍鋒;陳歷;樓丹
• 申請（專利權）人: 杭州九源基因工程有限公司
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 徐關壽

技術領域

本發(fā)明涉及化學分析和藥物分析領域，具體地說，涉及一種毛細管電泳方法用于測定達依泊汀α精細結構，即確定構成達依泊汀α糖組分的種類和含量。

背景技術

促紅細胞生成素(EPO)是一種調節(jié)紅細胞生成的糖蛋白激素，由腎臟細胞分泌。由于慢性腎衰竭(CRF)發(fā)展過程中腎臟組織逐漸被破壞，EPO分泌不足是腎性貧血的主要原因。自從上世紀80年代重組人促紅細胞生成素(rHuEPO)問世以來，就成為腎性貧血的主要治療手段，臨床上取得良好的治療效果。但其半衰期相對較短，通常需要每周給藥2一3次，給患者和醫(yī)護人員帶來不便，甚至有些患者因為恐懼注射而放棄治療。

達依泊汀α(darbepoetin?alfa)是rHuEPO高糖基化的類似物，是通過重組DNA技術在中國倉鼠卵巢(CHO)細胞內合成的(參見CN94109128.7)，已由美國Amgen公司開發(fā)上市，商品名Aranesp。達依泊汀α由5個N連接的糖基側鏈及22個唾液酸殘基組成,比rHuEPO多2個N連接糖基側鏈和8個唾液酸殘基（圖1）。rHuEPO是一種單鏈的酸性糖蛋白，含有165個氨基酸。EPO的糖基化修飾包括3個N末端糖鏈(分別位于天冬氨酸殘基Asp24、Asp38和Asp83)和1個絲氨酸氧末端糖鏈(位于Ser126)，其主要成分是甘露糖、巖藻糖和唾液酸等。而達依泊汀α通過定點突變的方式，改變了rHuEPO原有的5個氨基酸位點（Ala30Asn，His32Thr，Pro87Val，Trp88Asn和Pro90Thr），在第30和第88位氨基酸位置引入了兩個新的N-糖基化位點，但新位點的產生并不影響蛋白質3級結構和其與受體的結合。達依泊汀α的分子量為37KD，比rHuEPO(30.4KD)大，其糖基含量也由40％增加到52％。由于唾液酸殘基帶負電荷，因此本品所帶負電荷比rHuEPO多。

達依泊汀α的生物作用機制與rHuEPO和天然EPO相似，與前體紅細胞膜上的EPO受體結合，啟動細胞內信號轉導系統(tǒng)，促使前體紅細胞增殖、分化、生存期延長，從而使循環(huán)中的紅細胞數(shù)量和容量增加。靜脈注射達依泊汀α的半衰期是rHuEPO的3倍(分別為25.3和8.5小時)，清除率顯著低于rHuEPO

達依泊汀α的糖基化狀況直接影響其生物活性。糖蛋白中的寡糖存在微不均一性,達依泊汀α的質量控制關鍵在于寡糖分析。由于達依泊汀α所含的唾液酸較易脫落,而唾液酸能降低達依泊汀α在體內的代謝速度,因此需要能密切控制唾液酸組分即糖組分的分析方法。

理論上達依泊汀α具有22個唾液酸殘基，但是由于達依泊汀α所含的唾液酸較易脫落，因此實際上在通過細胞表達得到的達依泊汀α是糖組分存在微不均一性的混合蛋白，在質量控制中一般需要控制具有18-22個唾液酸殘基的達依泊汀α達到總組分的80%以上。

等電聚焦法是分析達依泊汀α糖組成成份的一種常用分離分析方法，這也是中國藥典規(guī)定的分析EPO的方法。但是用等電聚焦法只能做到定性分析，無法做到定量分析。

清華大學周國華等利用毛細管電泳技術測定rHuEPO的唾液酸微多相性。毛細管電泳分離是基于分子的體積/電荷比，其分離效率高于高效液相色譜。rHuEPO的糖基是唾液酸化的,并且唾液酸化的程度差異較大,例如N-連接糖鏈可能帶四個唾液酸,也可能帶三個、兩個或一個唾液酸。rHuEPO的等電點在4.0左右,當介質的p?H值大于等電點后,唾液酸帶負電,故可根據(jù)唾液酸的多少,通過電泳加以分離。毛細管電泳將rHuEPO分離成7個峰,這是由糖蛋白的唾液酸微多相性引起的,而在體積排阻H?P?L?C中僅有一個rHuEPO峰,因唾液酸與rHuEPO的體內活性有關,所以毛細管電泳比H?P?L?C更能反映rHuEPO的純度微多相性及生物學活性。

目前還沒有毛細管電泳技術測定達依泊汀α糖組成成份的報道。由于達依泊汀α的等電點在3.3左右，分離該酸性蛋白需要在較低的pH條件下進行，而這種低pH環(huán)境對于酸性蛋白的分離有較大負面影響，采用清華大學周國華等報道的毛細管電泳條件分離達依泊汀α無法取得良好的分離效果。本申請發(fā)明人經過多次摸索，建立了具有良好分離效果的達依泊汀α毛細管電泳技術，實現(xiàn)完全的基線分離。

發(fā)明內容

本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的基于毛細管電泳技術的達依泊汀α精細結構的分析方法，可用于達依泊汀α藥物生產過程的質量控制。

本發(fā)明涉及的毛細管電泳方法包括以下步驟：

（l）、通過毛細管電泳對含有達依泊汀α的樣品進行分離；

（2）、根據(jù)色譜峰面積對具有不同糖組分達依泊汀α進行定量測定。