[發明專利]一種褐飛虱細胞的原代培養方法

有效

• 申請號: 201310608825.7
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103667173A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 許益鵬;俞曉平;申屠旭萍;郝培應
• 申請（專利權）人: 中國計量學院
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

技術領域

本發明涉及屬于昆蟲細胞培養技術領域，尤其涉及一種褐飛虱細胞的體外培養方法。

背景技術

隨著生命科學的迅猛發展，在生物工程技術領域中，細胞工程已愈來愈受到重視。從某種意義上說，基因工程是現代生物技術的核心，而細胞工程是現代生物技術的基礎和公用平臺。自從Grace在1962年首次建立天蠶蛾細胞系以來，昆蟲細胞培養技術得到了迅速發展，400多株昆蟲細胞系得以建立，這包括常用的黑腹果蠅（Drosophila?melanogaster）S2細胞系、粉紋夜蛾（Trichoplusia?ni）的BTI-Tn-5B1-4（High?Five）細胞系和草地貪夜蛾（Spodoptera?frugiperda）Sf21細胞系及其克隆株Sf9。昆蟲細胞系的建立，不但促進了昆蟲生物學方面的基礎研究，也大大促進了基于昆蟲細胞的應用性研究。其中，昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統（BEVS）是當今最具高效的真核表達系統，已廣泛應用于β-干擾素等外源基因的表達。但是，現在已建立起的昆蟲細胞系多來源于鱗翅目昆蟲，來源于半翅目昆蟲的細胞系為數不多，目前只有玻璃葉蟬（Homalodisca?coagulata）和灰飛虱（Laodelphax?striatellus）有細胞系建成的報道，這極大地限制了半翅目昆蟲相關生物學的研究及其應用。

褐飛虱（brown?planthopper，BPH，Nilaparvata?lugens?(St?l)）屬于半翅目昆蟲，是亞洲稻區的主要害蟲之一。它主要通過吸食水稻韌皮部汁液、傳播水稻病毒兩種方式對水稻造成危害。褐飛虱的大面積暴發會引起水稻葉片干枯，分蘗枯萎，甚至形成“虱燒”。褐飛虱有很強的適應能力，能快速適應不利環境（如水稻抗性品種和殺蟲劑），其致害性能快速變異，這可能與褐飛虱體內存在大量的共生菌有關。雖然通過高溫或添加抗生素等方式可以獲得少菌的褐飛虱種群，但是由于這兩種方式對褐飛虱本身就有一定的副作用，因而在活體條件下難以研究褐飛虱和其共生菌的關系。而若有離體培養的褐飛虱細胞，則可以在離體條件下研究褐飛虱和其共生菌的互作，從而有助于闡明褐飛虱的致害性機制。另一方面，若有離體培養的褐飛虱細胞，也可以通過在細胞水平研究殺蟲劑對褐飛虱的作用機制，有助于當前殺蟲劑的改進和新殺蟲劑的發明。但目前，關于褐飛虱細胞的體外培養技術，還未見報道。因此，建立起一種褐飛虱細胞的離體培養方法，有助于褐飛虱防治工作的開展，并最終有利于糧食的安全生產，這具有重要的社會和經濟效益。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種褐飛虱細胞的原代培養方法。

本發明目的是通過以下技術方案得以實現的。

一種褐飛虱細胞的原代培養方法，按以下步驟進行：

（1）獲取發育時間在3天到4天的褐飛虱胚胎：褐飛虱雌成蟲和雄成蟲配對后放入裝有水稻（ASD7水稻）葉鞘的試管中，使它們在28℃條件下（白天黑夜時間比為L:D=16h:8h）產卵，在第二天的同一時間從葉鞘中剝出褐飛虱所產的卵，此卵定義為1天卵，依次獲得褐飛虱的3天卵和4天卵；在解剖鏡下，3天卵可看到明顯的黃斑，而4天卵可觀察到眼點；此3天卵或4天卵的發育時期處于反轉期前后，適合于后續的胚胎細胞培養。

（2）褐飛虱細胞培養基的配制：本發明所述的褐飛虱細胞培養基的配制方法：分別稱取Schneider’s?insect?medium?(SIGMA，S9895)?12.25g，Medium?199（Applichem，A1327，9010）5.35g；Medium?CMRL?1066（1×）（Gibco，11530-037）25mL；L-His·HCI·H₂O（SIGMA，H5659）2.36g；L-His（SIGMA，?H6034）2.135g；胎牛血清（Hyclone，SV30087.02）149mL-248mL；CaCl₂（分析純）0.3g；NaHCO₃（分析純）0.2g；氨芐青霉素鈉（上海生工，A0339）62mg；硫酸鏈霉素（上海生工，S0382）62mg；上述各成分混合，用超純水充分溶解后，用2M?NaOH或HC1溶液調節pH至6.5-6.6，而后用超純水定容至1240?mL，經0.22μm微孔濾膜過濾后置于4℃備用；過濾過程采用無菌操作，胎牛血清的體積終濃度為12%-20%。