[發(fā)明專(zhuān)利]一種褐飛虱細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310608825.7
• 申請(qǐng)日: 2013-11-27
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103667173A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許益鵬;俞曉平;申屠旭萍;郝培應(yīng)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)計(jì)量學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/07
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/07
• 代理公司: 杭州求是專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 周烽

1.一種褐飛虱細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

（1）獲取發(fā)育時(shí)間在3天到4天的褐飛虱胚胎：褐飛虱雌成蟲(chóng)和雄成蟲(chóng)配對(duì)后放入裝有水稻葉鞘的試管中，使它們?cè)?8℃條件下產(chǎn)卵；在第二天的同一時(shí)間從葉鞘中剝出褐飛虱所產(chǎn)的卵，定義為1天卵；依次獲得褐飛虱的3天卵和4天卵；在解剖鏡下，3天卵可看到明顯的黃斑，而4天卵可觀察到眼點(diǎn)；此3天卵或4天卵的發(fā)育時(shí)期處于反轉(zhuǎn)期前后，適合于后續(xù)的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)；

（2）褐飛虱細(xì)胞培養(yǎng)基的配制：分別稱(chēng)取12.25g的Schneider’s?insect?medium、5.35g的Medium?199、25mL?的Medium?CMRL?1066（1×）、2.36g的L-His·HCl·H₂O、2.135g的L-His、149mL-248mL胎牛血清、0.30g的CaCl₂、0.20g的NaHCO₃、62mg的氨芐青霉素鈉、62mg的硫酸鏈霉素等成分；上述各成分混合，加入超純水至1000?mL使上述成分充分溶解，再用2M?NaOH或HC1溶液調(diào)節(jié)pH至6.5-6.6，而后用超純水定容至1240?mL，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后置于4℃?zhèn)溆茫贿^(guò)濾過(guò)程采用無(wú)菌操作；

（3）機(jī)械法結(jié)合消化法分離褐飛虱胚胎的組織和細(xì)胞：取約100粒褐飛虱3天卵或4天卵，用體積百分比約為75%的酒精表面消毒5-10分鐘，接著用無(wú)菌的1×?PBS漂洗3遍，而后把卵轉(zhuǎn)移到小細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入100?μL的無(wú)菌1×?PBS，用無(wú)菌的彎尖眼科剪把卵剪碎，使卵中胚胎組織裸露到PBS中；用無(wú)菌的1mL槍頭把含有胚胎組織的PBS吸到1.5?mL的無(wú)菌離心管中，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，去除上部PBS，獲得胚胎組織沉淀；用100μL質(zhì)量體積比0.0025g/mL的胰蛋白酶溶液懸浮胚胎組織，37℃條件下消化1-5分鐘；往胰蛋白酶溶液加入一倍體積以上的步驟2配置的褐飛虱細(xì)胞培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化，800-1000轉(zhuǎn)/分鐘離心5-10分鐘，去除上清液，獲得消化后的胚胎組織和細(xì)胞沉淀；整個(gè)過(guò)程采用無(wú)菌操作；

（4）褐飛虱胚胎細(xì)胞的原代培養(yǎng)：用褐飛虱細(xì)胞培養(yǎng)基1200?μL懸浮上述褐飛虱胚胎組織和細(xì)胞沉淀，將其轉(zhuǎn)移到小細(xì)胞培養(yǎng)皿或6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用Parafilm封口膜包好后放置于27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；第2天，待組織和細(xì)胞貼壁后，更換新鮮褐飛虱細(xì)胞培養(yǎng)基，并視貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每隔5-8天更換一次褐飛虱細(xì)胞培養(yǎng)基；1個(gè)月后，即可以得到貼壁生長(zhǎng)的褐飛虱細(xì)胞群；整個(gè)過(guò)程采用無(wú)菌操作。