[發明專利]配基修飾提高微球介質電荷密度促進蛋白質復性的方法

無效

• 申請號: 201310608786.0
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103601791A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 孫彥;楊春燕;史清洪;董曉燕
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

技術領域

本發明涉及配基再修飾提高微球介質電荷密度促進蛋白質復性的技術，屬于生物技術領域中的蛋白質復性技術。

背景技術

基因工程技術的快速發展，為人類破譯重大疾病、開發新型藥物提供了重要技術支撐。目前，基因工程藥物開發已逐漸進入成熟期，此類藥物的生產必須借助適宜的重組基因表達系統。細菌表達系統因其具有表達量高、易于放大等優點，被廣泛使用。但是利用該表達體系生產重組蛋白質時，往往由于目標蛋白質的表達量過高而在細胞內發生錯誤折疊及聚集，生成包涵體。包涵體不具有生物學活性，必須通過折疊復性以獲得具有生物學活性的天然結構。在包涵體蛋白質的折疊復性過程中，變性蛋白質或折疊中間體間的疏水性相互作用極易引發蛋白質分子間聚集，因此抑制蛋白質聚集是促進復性的關鍵。

在復性過程中，通過加入低濃度鹽酸胍和尿素、精氨酸、表面活性劑等小分子添加劑可以提高折疊中間體或伸展肽鏈的溶解度，從而抑制蛋白質聚集(Molecular?level?insight?into?intra-solvent?interaction?effects?on?protein?stability?and?aggregation.Advanced?Drug?Delivery?Reviews,2011,63,1074-1085)。但是大多數添加劑在抑制蛋白質聚集同時也會抑制蛋白質分子的折疊，造成折疊速率的降低。

近年來色譜復性技術受到研究者的廣泛關注。色譜復性分為凝膠過濾色譜復性，吸附色譜復性以及固定化輔助因子色譜復性等。色譜復性集成了蛋白質復性和色譜分離純化技術，同時實現了目標蛋白質的復性和分離純化。但色譜介質與蛋白質分子間的吸附作用會導致蛋白質分子折疊速率的降低。此外，色譜復性后的產品濃度較低。

為了克服小分子添加劑輔助復性和色譜復性技術的不足，近來有報道提出利用與復性蛋白質帶有同種電荷的微球介質，如瓊脂糖凝膠介質、經高分子量（平均分子量為60000）的聚乙烯亞胺PEI（將其命名為PEIL）一次修飾的聚甲基丙烯酸縮水甘油酯微球介質PGMA-PEIL等抑制蛋白質聚集、促進蛋白質復性的方法(Ion-exchange?resins?greatly?facilitate?refolding?of?like-charged?proteins?at?high?concentrations.Biotechnology?and?Bioengineering,2011,108,1068-1077;Ion-exchange?resins?facilitate?like-charged?protein?refolding:Effects?of?porous?solid?phase?properties.Journal?of?Chromatography?A,2012,1225,168-173;Mono-sized?microspheres?modified?with?poly(ethylenimine)facilitate?the?refolding?of?like-charged?lysozyme.Reactive?and?Functional?Polymers,2012,72,889-896)。與傳統的復性方法相比，同電荷微球介質促進蛋白質復性方法操作簡單、介質回收方便且無需昂貴的大型設備。其中的瓊脂糖凝膠介質比表面積較大，可被修飾為高電荷密度介質，但是其機械強度較差；相對于瓊脂糖凝膠介質，無孔單分散PGMA-PEIL微球介質具有更好的機械強度，并可被修飾為超順磁性微球從而大大簡化分離操作，但是受到無孔微球介質較小的比表面積以及修飾方法本身的限制，PGMA-PEIL微球介質的電荷密度有限，限制了其輔助復性的效果。為了克服上述的缺陷，本發明提出了一種通過配基再修飾提高表面帶環氧基團微球介質電荷密度的方法，相較一次修飾微球介質，該介質促進了蛋白質復性效果。該法不僅具有介質用量少、蛋白質復性收率高的特點，而且對高鹽等環境具有更好的耐受性。

發明內容