[發(fā)明專利]配基修飾提高微球介質(zhì)電荷密度促進蛋白質(zhì)復性的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310608786.0
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103601791A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫彥;楊春燕;史清洪;董曉燕
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 王麗

1.配基再修飾提高微球介質(zhì)電荷密度促進蛋白質(zhì)復性的方法，其特征在于配基為DEAE或PEIS配基，步驟如下：

1）合成無孔單分散微球介質(zhì)PGMA，并在PGMA微球介質(zhì)表面修飾平均分子量為60000的聚乙烯亞胺PEIL，制備得到一次修飾微球介質(zhì)PGMA-PEIL；

2）通過親核反應配基修飾于PGMA-PEIL微球介質(zhì)表面的PEIL配基上，制備得到配基再修飾微球介質(zhì)PGMA-PEIL-DEAE或PGMA-PEIL-PEIS；

3）將上述步驟2）中的配基再修飾微球介質(zhì)加入同電荷蛋白質(zhì)的復性緩沖液中，然后加入變性蛋白液復性；

4）復性完成后，離心收集上清液，獲得復性蛋白質(zhì)溶液。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3）復性緩沖液為：20～100mmol/L三羥甲基氨基甲烷、1～3mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、0～0.1mol/L?NaCl及0～2mol/L尿素的混合物；pH值為7.5～9.0。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟3）同電荷蛋白質(zhì)為與配基再修飾微球介質(zhì)帶有相同電荷的蛋白質(zhì)。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2）中，PGMA-PEIL-DEAE的制備方法是：稱取1.0～5.0g?PGMA-PEIL微球介質(zhì)于錐形瓶中，加入5～25mL濃度為0.1～1.5mol/L的2-二乙胺基氯乙烷鹽酸鹽溶液以及等體積的濃度為3.5mol/L的NaOH溶液，使PGMA-PEIL微球介質(zhì)在反應體系中的濃度為50～100g/L；上述體系置于50～60℃、50～170rpm條件下反應1～2h；冷卻后，將微球介質(zhì)用去離子水，在轉(zhuǎn)速為5000～8000rpm的條件下反復離心水洗，直至將游離的DEAE和NaOH清洗干凈。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟2）中，PGMA-PEIL-PEIS的制備方法是：稱取1.0～5.0g?PGMA-PEIL微球介質(zhì)于錐形瓶中，加入10～50mL戊二醛體積分數(shù)為10%的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸鈉緩沖液，使PGMA-PEIL微球介質(zhì)在反應體系中的濃度為50～100g/L，于25～30℃、50～170rpm的條件下反應4～6h；反應結(jié)束后，將微球介質(zhì)用去離子水，在轉(zhuǎn)速為5000～8000rpm條件下反復離心水洗，直至將游離的戊二醛清洗干凈；隨后，將微球介質(zhì)移入10～50mL含有50～200g/L?PEIS的50mmol/L、pH9.0的硼酸/硼酸鈉緩沖液中，使微球介質(zhì)在反應體系中的濃度為50～100g/L，于25～30℃、50～170rpm條件下反應48～60h；反應結(jié)束后，將微球介質(zhì)用去離子水，在轉(zhuǎn)速為5000～8000rpm條件下反復離心水洗，去除未反應的PEIS；接著，將微球介質(zhì)移入10～50mL濃度為0.5mol/L的NaBH₄溶液中，使微球介質(zhì)在反應體系中的濃度為50～100g/L，于25～30℃、50～170rpm的條件下反應4～6h，以還原未反應醛基；最后用去離子水，在轉(zhuǎn)速為5000～8000rpm條件下反復離心水洗，去除NaBH₄。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟4）方法是：將配基再修飾微球介質(zhì)加入到由20～100mmol/L?Tris–HCl、1～3mmol/L?EDTA、0～0.1mol/L?NaCl及0～2mol/L尿素組成，且pH值為7.5～9.0的復性緩沖液中，使最終復性體系中配基再修飾微球介質(zhì)的濃度為20～150mg/mL；上述混合物置于溫度為20～37℃的空氣振蕩器中振蕩預平衡直至溫度恒定；加入待復性的變性蛋白液，使復性體系中蛋白質(zhì)濃度為1～4mg/mL；混合均勻后，置于空氣振蕩器中，在轉(zhuǎn)速為50～170rpm條件下復性，復性溫度與此前復性緩沖液預平衡的溫度相同。

7.權(quán)利要求1～6任意一項所述的方法，應用于復性過程中易發(fā)生聚集的蛋白質(zhì)復性，所述的蛋白質(zhì)包括含有二硫鍵蛋白質(zhì)和不含二硫鍵的蛋白質(zhì)。