[發(fā)明專利]一種提高體外受精胚胎發(fā)育率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310608158.2
• 申請日: 2013-11-26
• 公開（公告）號: CN103589682B
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉忠華;郇延軍;牟彥雙;孔慶然;朱江;呂明
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075;C12Q1/02
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種提高體外受精胚胎發(fā)育率的方法，其特征在于，步驟如下：

1)在豬卵母細(xì)胞體外成熟液中培養(yǎng)具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；

2)通過檢測豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中極體排放比例，確定豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)時間為33-42h；

3)通過檢測豬成熟卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量，將豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)至33-39h進(jìn)行體外受精；

4)成熟卵母細(xì)胞體外受精前的準(zhǔn)備

將體外成熟培養(yǎng)卵母細(xì)胞移入預(yù)先平衡的受精液中洗滌，然后移入預(yù)平衡的受精液微滴中,置入二氧化碳培養(yǎng)箱中等待體外受精，每個受精滴放入成熟卵母細(xì)胞；

5)精子的準(zhǔn)備

采取新鮮精液，用精液稀釋粉進(jìn)行稀釋，取出精液于烘箱孵育，離心棄上清，用含BSA的DPBS懸浮，重復(fù)離心，懸浮，然后利用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)，并利用受精液調(diào)整精子濃度；

6)體外受精

取精子懸液加入到受精滴中，將成熟卵母細(xì)胞與精子在二氧化碳培養(yǎng)箱中共孵育；

7)體外受精胚胎體外培養(yǎng)及檢測

將成熟的卵母細(xì)胞與精子共培養(yǎng)后從受精滴中挑出，然后用欲平衡的胚胎培養(yǎng)液將受精卵洗滌，轉(zhuǎn)到預(yù)平衡的胚胎培養(yǎng)液滴中，移入受精卵，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下：

1)在豬卵母細(xì)胞體外成熟液中培養(yǎng)具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；

2)通過檢測豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中極體排放比例，確定豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)時間為33-42h；

3)通過檢測豬成熟卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量，將豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)至33-36h進(jìn)行體外受精。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下：

1)在豬卵母細(xì)胞體外成熟液中培養(yǎng)具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞；

2)通過檢測豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中極體排放比例，確定豬卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)時間為33-42h；

3)通過檢測豬成熟卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量，將豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)至33h進(jìn)行體外受精。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)步驟為：收集卵巢，抽取直徑為3-5mm的有腔卵泡，在洗卵液中洗滌，實體顯微鏡下挑選具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，然后在成熟液中洗滌，將洗凈的卵母細(xì)胞移入卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)滴中，每滴放入40-50枚卵細(xì)胞，最后置入飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)步驟為：收集卵巢并在37℃的生理鹽水中，抽取直徑為3-5mm的有腔卵泡，在洗卵液中洗滌3次，實體顯微鏡下挑選具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞，然后在成熟液中洗滌3次，將洗凈的卵母細(xì)胞移入500μL卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)滴中，每滴放入40-50枚卵細(xì)胞，最后置入培養(yǎng)的條件為38.5℃，5％CO₂，飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。