[發明專利]一種菠蘿成熟衰老相關基因的分子標記方法

無效

• 申請號: 201310607475.2
• 申請日: 2013-11-27
• 公開（公告）號: CN103642908A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 張魯斌;常金梅;賈志偉;谷會;弓德強;洪克前
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域：

本發明涉及一種菠蘿成熟衰老相關基因的分子標記方法技術領域。

背景技術：

菠蘿是重要的熱帶水果，備受大家關注，但是菠蘿基因組序列尚不清楚，現有分子標記不能滿足研究需要，這給菠蘿基因定位和多態性分析帶來了不便。對菠蘿進行多態性分析的分子標記方法很多，如SSR、SNP、RFLP等。大多數是借用其它物種現有的分子標記，或對有限的DNA序列進行掃描，查找獲得。但是獲得的這些標記，針對性不強，沒有特異對某一生物途徑相關的基因進行標記。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種菠蘿成熟衰老相關基因的分子標記方法，通過對菠蘿果實衰老過程的RNA進行測序，查找與該事件相關基因的SSR標記。

為了解決背景技術所存在的問題，本發明采用以下技術方案：

一種菠蘿成熟衰老相關基因的分子標記方法，包括以下步驟：

(1)提取采后菠蘿衰老過程各階段的RNA；

(2)通過Illumina?Solexa?Hiseq2000對菠蘿成熟衰老過程中的轉錄組進行了測序，組裝得到了81129個unique基因；

(3)在此基礎上使用SSR軟件MicroSAtell?ite(MISA)進行了SSR掃描，找到了35099個SSR分子標記，供菠蘿多態性分析；

(4)對所有SSR重復單元在Unigene上前后序列的長度進行篩選。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其設計引物；

(5)不同物種間，進行PCR擴增并通過PAGE技術進行多態性檢測。

進一步地，所述的步驟(1)中，在此過程植物組織樣品不能解凍，提取的RNA質量要求是28S／18S約2倍。

進一步地，所述的步驟(2)中，RNA測序數據量要大于5G以上，質控標準要大于Q20以上。

進一步地，所述的步驟(3)中，分別對1-6個核苷酸組成的重復序列進行篩選。

進一步地，所述的步驟(4)中，引物篩選條件如下：引物不能存在SSR；將獲得的引物與Unigene序列比對，引物的5′端允許有1-3個堿基的錯配，3′端允許有1個堿基的錯配，末端堿基除外；去掉與Unigene序列不匹配的引物，選擇唯一匹配的引物；使用SSR_finder校驗SSR，使用產物序列來尋找SSR，檢驗結果是否與MISA結果相同，并篩選出相同的SSR產物。

進一步地，所述的步驟(5)中，優化擴增體系，控制PCR擴增飽和度，避免非特異擴增；PAGE電泳上樣量3-5μL。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明針對采后菠蘿果實衰老過程的幾個階段，收集提取樣品RNA進行測序，獲得了菠蘿衰老相關的基因表達譜，然后對獲得的序列進行SSR標記掃描，確認其多態性。因為這些標記都是同衰老相關基因相連，可以對菠蘿不同品種之間的衰老相關性狀進行多態性分析。

附圖說明：

圖1是本發明方法流程圖。

圖2是本發明原理解釋圖。

具體實施方式：

下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步描述：

圖1是本發明方法流程圖。一種菠蘿成熟衰老相關基因的分子標記方法，包括以下步驟：

(1)提取采后菠蘿衰老過程各階段的RNA；

(2)通過Illumina?Solexa?Hiseq2000對菠蘿成熟衰老過程中的轉錄組進行了測序，組裝得到了81129個unique基因；

(3)在此基礎上使用SSR軟件MicroSAtellite(MISA)進行了SSR掃描，找到了35099個SSR分子標記，供菠蘿多態性分析；

(4)對所有SSR重復單元在Unigene上前后序列的長度進行篩選。只保留前后序列均不小于150bp的SSR，用其設計引物；

(5)不同物種間，進行PCR擴增并通過PAGE技術進行多態性檢測。

進一步地，所述的步驟(1)中，在此過程植物組織樣品不能解凍，提取的RNA質量要求是28S／18S約2倍。

進一步地，所述的步驟(2)中，RNA測序數據量要大于5G以上，質控標準要大于Q20以上。

進一步地，所述的步驟(3)中，分別對1-6個核苷酸組成的重復序列進行篩選。