[發(fā)明專利]一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310606470.8
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103613659A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張振斌;侯玉文;田云霞;李克錦;劉萍;欒大偉
• 申請（專利權(quán)）人: 博奧賽斯（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/765
• 分類號: C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K14/47;C07K1/107
• 代理公司: 天津?yàn)I海科緯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 李莉華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的是一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法。

背景技術(shù)

有機(jī)磷農(nóng)藥屬有機(jī)磷酸酯類的一組化合物，是目前廣泛應(yīng)用于防治糧、棉、水果及蔬菜蟲害的農(nóng)藥。對人畜具有毒性，在生產(chǎn)和使用過程中不注意防護(hù)，可引起中毒。雖然與已禁用的有機(jī)氯農(nóng)藥相比其在環(huán)境中降解快，殘毒低，但由于使用量大，加上違章非正常操作，不僅糧食、蔬菜農(nóng)藥殘留問題日漸突出，在生產(chǎn)和使用這些農(nóng)藥的過程中殘留的農(nóng)藥會將污染延伸到環(huán)境水體中，對地表水、地下水造成污染。目前有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測方法主要有兩大類——色譜檢測法和快速檢測法。色譜檢測法是目前農(nóng)藥殘留主要的檢測方法，包括氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法。其特點(diǎn)是檢測時間稍長，但檢測精度高，可為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供依據(jù)。農(nóng)藥殘留快速檢測法是一類快速檢測農(nóng)藥殘留的方法，包括免疫分析技術(shù)、酶抑制法等。

有機(jī)磷的免疫法檢測不僅方法簡便，成本低廉，而且靈敏度高。但建立高效的免疫法檢測需要高品質(zhì)的抗原和抗體。但是，有機(jī)磷類化合物均是小分子，不具備免疫原性，不能直接產(chǎn)生抗體。因此，需要一種簡單可靠的方法，合成一種能夠激發(fā)動物產(chǎn)生抗體的完全抗原。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種制備方法簡單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于有機(jī)磷抗體制備和免疫學(xué)檢測的完全抗原。

本發(fā)明是在分析了大量常用的有機(jī)磷農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的情況下，應(yīng)用4-氨基芐基磷酸二乙酯（DAP）作為半抗原，制備完全抗原。其特點(diǎn)是具備大部分有機(jī)磷的共同結(jié)構(gòu)，并且結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜。采用戊二醛作為橋聯(lián)劑，將4-氨基芐基磷酸二乙酯（DAP）通過五個碳的橋與載體蛋白連接，從而使半抗原完全暴露在載體蛋白的表面，有利于抗體的識別，免疫原性得到增強(qiáng)，有利于動物產(chǎn)生抗體。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種4-氨基芐基磷酸二乙酯完全抗原的制備方法，包括以下步驟：

（1）將4-氨基芐基磷酸二乙酯溶于去離子水制備抗原溶液，戊二醛溶于去離子水制備橋聯(lián)劑溶液，載體蛋白溶于pH9.6的0.05M碳酸鹽緩沖液制備載體蛋白溶液；

（2）將載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合并4℃避光攪拌30分鐘；

（3）用0.01M磷酸鹽緩沖液透析或者超濾除去載體蛋白溶液和橋聯(lián)劑溶液混合液中游離的橋聯(lián)劑，得到活化后的載體蛋白溶液；

（4）抗原溶液緩慢滴入活化后的載體蛋白溶液中，4℃攪拌20小時以上，經(jīng)透析、脫鹽或者超濾除去游離抗原，得偶聯(lián)物；

（5）加NaBH₄溶液還原偶聯(lián)物。

進(jìn)一步，步驟（1）中，所述載體為含有游離氨基的蛋白大分子。

進(jìn)一步，所述的蛋白大分子為牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍(lán)蛋白。

進(jìn)一步，所述步驟（1）中，所述抗原溶液濃度為10mmol/L，載體蛋白溶液濃度為0.5mmol/L，橋聯(lián)劑溶液濃度為50mmol/L。

進(jìn)一步，所述步驟（2）中按照血管緊張素與載體蛋白摩爾比10-20:1的比例。

采用紫外分光光度計對載體蛋白、未偶聯(lián)小分子、偶聯(lián)物在200-500nm之間進(jìn)行掃描，在同坐標(biāo)下進(jìn)行圖形比對，在偶聯(lián)物和載體蛋白對照濃度相同的情況下，如果偶聯(lián)物的特征峰與載體蛋白特征峰及實(shí)驗(yàn)對照組特征峰相比發(fā)生明顯偏移，說明偶聯(lián)成功。

實(shí)驗(yàn)對照組按照上述步驟（1）-（5）制備，只是不添加抗原溶液。

戊二醛法原理：戊二醛是一種常用交聯(lián)劑，兩端的醛基均可與伯氨基縮合。本方法就是利用其交聯(lián)劑的特性，將4-氨基芐基磷酸二乙酯（DAP）的氨基及載體蛋白中的伯氨基交聯(lián)在一起。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是提供一種制備方法簡單、生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低的用于4-氨基芐基磷酸二乙酯抗體制備和免疫學(xué)檢測的完全抗原，直接應(yīng)用于免疫檢測。

附圖說明：

圖1是偶聯(lián)物通過分光光度計掃描鑒定圖

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1??4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA偶聯(lián)

（1）將4-氨基芐基磷酸二乙酯溶于去離子水制備抗原溶液，載體蛋白BSA溶于去離子水制備載體蛋白溶液，戊二醛溶于去離子水制備催化溶液，4-氨基芐基磷酸二乙酯抗原溶液為10mmol/L（即3.37mg/ml），載體蛋白BSA溶液為0.5mmol/L（即33mg/ml）B，戊二醛溶液為20mmol/L（即3.82mg/ml）；

（2）將戊二醛溶液和載體蛋白BSA4℃避光攪拌30分鐘，4-氨基芐基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA的摩爾比為20：1；