[發明專利]一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法

有效

• 申請號: 201310606411.0
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103575876A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 張振斌;辛志勇;汪艷培;李克錦;劉萍;欒大偉
• 申請（專利權）人: 博奧賽斯（天津）生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司 12211
• 代理人: 李莉華

技術領域

本發明屬于免疫學技術領域，具體的是一種T4-HRP的制備方法。

背景技術

甲狀腺素即3，5，3'，5'-四碘甲狀腺原氨酸，簡稱T4(Thyroxine，T4)，是由甲狀腺濾泡上皮細胞合成和分泌的甲狀腺激素。甲狀腺素的基本結構是由一個酪氨酸殘基和一個酚環構成。正常人平均每日的T4分泌量為（90±9）μg，約為甲狀腺內貯存量的1%。T4進入血液循環后約99.96%與結合蛋白結合，其中約60%與甲狀腺素結合球蛋白（TBG）結合，30%與甲狀腺素結合前白蛋白（TBPA）結合，其余與白蛋白結合。

T4具有生物活性，促進糖，脂肪，蛋白質代謝，產生能量和熱，促進生長發育。甲狀腺機能亢進時，甲狀腺合成和分泌T4增多，血清T4增高。亞急性甲狀腺炎，慢性淋巴細胞性甲狀腺炎的早期，因甲狀腺濾泡受破壞，T4溢出，使血中T4升高產生暫時性的輕度甲亢。甲狀腺機能減退時，無論是原發，繼發或其它原因，T4均減低，甲狀腺缺乏或先天性發育不良，及甲狀腺全切除后，血清T4降低。

臨床上血清T4的檢測主要采用免疫法，而且固相包被T4抗體是T4檢測試劑盒的常用方式，這就需要對T4抗原進行標記以達到檢測血清T4的目的。而目前市場上的T4標記抗原多要先偶聯一個載體蛋白才能有效進行標記，此種方法在空間上對針對T4的抗原抗體反應必然會產生較大影響，從而導致檢測結果出現偏差。

發明內容

本發明的目的是為了解決上述技術問題，提供一種制備方法簡單、生產周期短，生產成本低的用于T4免疫學檢測的T4-HRP。

技術方案包括下述步驟：

一種甲狀腺素標記辣根過氧化物酶的制備方法，包括以下步驟：

（1）將T4與HRP分別溶于二甲基亞砜溶液和碳酸鹽緩沖液中，分別制備A溶液和B溶液，然后在A溶液中加入正三丁胺溶液，冰浴持續攪拌一定時間，得溶液C，溶液C再加入氯甲酸異丁酯溶液，室溫攪拌一定時間后，得溶液D，將B溶液加入溶液D進行偶聯反應，得到反應混合液E。

（2）反應混合液E通過透析處理除去反應混合物中未參與偶聯的小分子物質，緩沖液采用pH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯物，未偶聯的小分子物質包括T4及DMSO、正三丁胺、氯甲酸異丁酯等。

進一步，步驟（1）中制備的A溶液和B溶液的濃度分別為1mg/ml和5mg/ml。

進一步，所述溶液C中T4與HRP摩爾比5-10:1。

進一步，步驟（1）中正三丁胺加入T4溶液需冰浴。

進一步，氯甲酸異丁酯加入量大于T4的物質的量。

進一步，步驟（1）中B溶液緩慢滴加到溶液D中，邊滴邊震蕩，滴加完成后4℃持續震蕩，反應20小時以上，得到反應混合液E。

偶聯完成的檢測采用如下方法：

按照上述步驟（1）和步驟（2）的方法，反應體系缺失T4，維持其他各反應條件不變，制備實驗對照組樣品。

采用紫外分光光度計對T4、T4-HRP、實驗對照在200-400nm之間進行掃描，在同坐標下進行圖形比對，在T4-HRP、實驗對照和T4對照濃度相同的情況下，如果T4-HRP的特征峰與T4特征峰及實驗對照組特征峰相比多出特征吸收峰，說明偶聯成功。

本發明的優點是提供一種制備方法簡單、生產周期短，生產成本低的用于去甲腎上腺素抗體制備和免疫學檢測的完全抗原，直接應用于免疫檢測。

附圖說明：

圖1是偶聯物通過分光光度計掃描鑒定圖

具體實施方式：

實施例1：T4標記HRP

（1）T4（甲狀腺素）5mg溶于1mlDMSO中得A溶液，HRP5mg溶于1mlpH9.6碳酸鹽緩沖液中得B溶液；

（2）將體積為5ul的正三丁胺滴入A溶液中，冰浴震蕩反應20分鐘，得溶液C。

（3）將體積為5ul的氯甲酸異丁酯滴入溶液C中，室溫震蕩反應30分鐘，得溶液D。

（4）將溶液D緩慢滴入B溶液中，4℃震蕩反應24小時以上，得反應混合物E。

（5）反應混合物E通過透析處理除去反應混合物中未偶聯的小分子物質，緩沖液采用PH7.4的0.01M磷酸鹽緩沖液，得偶聯物F。

（6）按照步驟（1）（2）（3）（4）（5）的方法，反應體系缺失T4，維持其他各反應條件不變，制備實驗對照樣品。

（7）采用紫外分光光度計對載體、小分子、偶聯物在200-500nm之間進行掃描，在同坐標下進行圖形比對，在偶聯物和載體對照濃度相同的情況下，如果偶聯物的特征峰與載體特征峰及實驗對照組特征峰相比發生明顯偏移，說明偶聯成功。