[發明專利]水蛭指紋圖譜的建立方法及其標準指紋圖譜

有效

• 申請號: 201310605877.9
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103558329A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 趙志全;蘇瑞強;劉武占;李蔚群
• 申請（專利權）人: 魯南厚普制藥有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.水蛭指紋圖譜的建立方法，其特征在于將水蛭制備成供試品溶液，經過高效液相色譜儀分離檢測，獲得水蛭的指紋圖譜；

所述方法包括如下步驟：

1）供試品溶液的制備：取水蛭粗粉，以甲醇溶液回流提取，離心，取上清液加在堿性氧化鋁層析柱上，收集過柱液，再以水洗脫，合并過柱液及水洗脫液，過濾，作為供試品溶液；

2）參照物溶液的制備：取尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A對照品，溶于甲醇溶液作為參照物溶液；

3）制作水蛭指紋圖譜：分別精密吸取供試品溶液和參照物溶液，經高效液相色譜儀分離檢測，其中，流動相的組成為10mmol/L的磷酸二氫鉀溶液—乙腈；采用梯度洗脫；得到水蛭指紋圖譜。

2.如權利要求1所述的水蛭指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述供試品溶液按如下步驟制備：精密稱取水蛭粗粉5g，置具塞容器中，精密加入50%甲醇溶液50ml，水浴回流提取30min，以10000rpm的速度高速離心10min，精密量取上清液20ml，加在堿性氧化鋁柱（氧化鋁為6g，100～200目，層析柱內徑為1.5cm）上，收集過柱液，再用水30ml洗脫，合并過柱液及水洗脫液，置50ml容量瓶中，加水至刻度，搖勻，經0.45μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

3.如權利要求1所述的水蛭指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述的高效液相色譜儀分離檢測條件為：色譜柱為YMC-Pack-ODS-AQ?C₁₈柱（250x4.6mm，5μm）；流動相為10mmol/L的磷酸二氫鉀溶液—乙腈；采用梯度洗脫：0min→15min→40min→60min，乙腈0%→0%→20%→20%；流速0.8ml/min；檢測波長254nm；進樣量10μl；柱溫30℃。

4.如權利要求1所述的水蛭指紋圖譜的建立方法，其特征在于所述參照物溶液按如下步驟制備：取尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B、水蛭胺A對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解并稀釋成每1ml中含尿嘧啶30μg、次黃嘌呤80μg、黃嘌呤20μg、尿苷20μg、水蛭胺C30μg、水蛭胺B30μg和水蛭胺A30μg的混合溶液，搖勻。

5.由權利要求1至4中任一項所述的水蛭指紋圖譜的建立方法得到的水蛭標準指紋圖譜，其特征在于：有13個特征峰，第3、5、6、7、9、10、12號色譜峰分別依次對應尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、尿苷、水蛭胺C、水蛭胺B和水蛭胺A，其中5號次黃嘌呤峰最強，圖譜總長度為60min，平均保留時間t如下：

1號峰，平均保留時間t為4.6min；

2號峰，平均保留時間t為7.3min；

3號峰，平均保留時間t為8.4min；

4號峰，平均保留時間t為10.3min；

5號峰，平均保留時間t為14.9min；

6號峰，平均保留時間t為18.0min；

7號峰，平均保留時間t為20.2min；

8號峰，平均保留時間t為26.8min；

9號峰，平均保留時間t為30.7min；

10號峰，平均保留時間t為33.2min；

11號峰，平均保留時間t為35.4min；

12號峰，平均保留時間t為37.1min；

13號峰，平均保留時間t為40.9min。