[發明專利]食用植物油中轉基因成分NOS的恒溫檢測方法和檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201310603898.7
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103642796A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 譚貴良;李向麗;劉垚;袁秀金;陳亞波
• 申請（專利權）人: 譚貴良
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

技術領域

本發明屬于生物分子檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測食用植物油中NOS終止子的方法和試劑盒。

背景技術

自20世紀70年代轉基因生物和轉基因產品被開發以來，轉基因產品發展迅猛。轉基因作物的種植面積得到了前所未有的增長，從1996年的170萬公頃到2012年的1.7億公頃，增加了100倍。種植轉基因作物的國家也達到了28個，其中20個為發展中國家，8個為發達國家。到目前為止，已經有25種轉基因作物被商業化種植，其中最廣泛的是作為食用油加工原料的大豆、玉米、油菜。由于這些轉基因油料作物出油率高、制油成本低，各發展中國家紛紛進口轉基因大豆和油菜作為制油原料。但由于目前尚缺乏科學依據證明轉基因食品的安全性，因而對轉基因食品檢測技術的需求也越來越緊迫。近年來，中國進口的制油原料中，有相當數量的轉基因產品，尤其是轉基因大豆，中國進口的大豆幾乎100%為轉基因大豆。由于世界上已經有很多國家規定了轉基因食品是必須加貼標簽或禁止進口，因此，對食用油脂進行轉基因成分的檢測，顯得尤為重要。如何鑒別食用油脂是否為轉基因食品，除了檢測原料以外，更多的是需要從成品食用油中直接進行檢測。轉基因作物所轉入的外源基因多種多樣，為了成功表達這些外源基因，均需要插入如啟動子、終止子等外源調控序列。NOS終止子作為最常使用的調控序列之一，被廣泛用于轉基因植株的構建，是轉基因檢測的最佳靶基因之一。

轉基因成分的檢測一直是食品衛生與食品安全檢測的重點內容，尤其是轉基因成分的快速檢測已成為一個重要的研究方向。目前檢測的外源基因包括35S啟動子、NOS終止子和功能基因。檢測方法主要有兩類：一是建立在蛋白質水平上的Western印記、SDS-PAGE、ELISA等方法；二是基于核酸擴增的PCR方法（包括多重PCR、競爭PCR、實時熒光PCR等）。特別是實時熒光PCR檢測方法，一直作為轉基因成分檢測的標準方法在使用。雖然其檢測靈敏度較高，但需要昂貴的熒光定量PCR儀，檢測成本也極高。因此，建立一種普適性好、簡便易操作、低成本的快速檢測方法對于實際檢測工作意義極為重要。從食用油脂中提取出可用于核酸檢測的DNA，是進行檢驗的關鍵。但是食用油的DNA提取仍是國內外的難題之一。由于食用油生產加工過程中經過高溫和高壓等處理過程，產品中的DNA遭到嚴重破壞，降解為長度較短，大小不一的片段，而且受到物理、化學和生物等因素的影響，DNA的質量也大大降低。目前，國內外仍沒有一個比較穩定的食用油DNA提取方法或試劑盒。

環介導恒溫擴增技術（Loop-Mediated?Isothermal?Amplification，LAMP)是2000年由日本研究人員Notomi等發明的一項新的DNA擴增技術，具有常規PCR技術無法具備的簡單、快速、靈敏、特異性強的特點。該技術利用具有鏈置換活性Bst?(Bacillus?stearothermophilus)DNA聚合酶和根據靶序列設計的兩對特異性內引物及外引物，特異識別靶序列上的六個獨立區域，啟動循環鏈置換反應，同時還可引入環引物以縮短反應時間。該技術克服了傳統PCR反應需要通過反復的熱循環擴增的缺點，避免了反復升降溫的耗時過程，可實現恒溫條件下的連續快速擴增，具有更高的靈敏度（低于10個拷貝）和擴增效率。同時，由于兩對引物針對靶基因的6個區域，這使LAMP也具有極高的擴增特異性。

本研究建立了一種可從食用油中穩定提取核酸的方法，同時建立一種恒溫檢測NOS終止子的方法。該方法具有快速簡便、操作簡單、檢測耗時少、靈敏度、數據準確可靠以及結果易判定的優點。目前尚未有采用LAMP技術對食用油轉基因成分進行檢測研究的報道。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種用于穩定、快速提取植物油中基因組DNA的方法。

本發明的另一個目的是提供一種用于快速提取植物油中基因組DNA的試劑盒。

本發明的另一個目的在于提供一種快速檢測植物油中NOS終止子的方法。

本發明的另一個目的在于提供一種用于快速檢測植物油中NOS終止子的LAMP試劑盒。

本發明的另一個目的在于提供一種用于快速檢測植物油中NOS終止子的LAMP引物組。

本發明所采取的技術方案是：

一種提取植物油基因組DNA的方法，包括如下步驟：

1）取一定樣品油，加入1～3倍體積的正己烷和0.1～0.3倍體積的TE，20～25℃環境條件下，混合均勻；

2）靜置分層后，去除上層油相；