[發明專利]食用植物油中轉基因成分NOS的恒溫檢測方法和檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201310603898.7
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103642796A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發明（設計）人: 譚貴良;李向麗;劉垚;袁秀金;陳亞波
• 申請（專利權）人: 譚貴良
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

1.一種提取植物油基因組DNA的方法，包括如下步驟：

1）取一定樣品油，加入1～3倍體積的正己烷和0.1～0.3倍體積的TE，20～25℃環境條件下，混合均勻；

2）靜置分層后，去除上層油相；

3）將下層的TE水相轉移到離心管；依次加入1～2?μg鮭魚精DNA，0.5～0.7倍體積預冷的異丙醇，0.1～0.2倍體積的3?mol/L的乙酸鈉；輕輕來回顛倒混勻后置于-20℃以下沉淀DNA；

4）沉淀過夜后離心，棄上清液，用預冷的65～75%的乙醇洗滌沉淀，轉移到離心管，離心；

5）空干DNA，加入TE溶解DNA，置于－20℃以下保存。

2.一種用于提取植物油基因組DNA的試劑盒，包括以下試劑：正己烷、TE試劑、鮭魚精DNA、異丙醇、乙酸鈉和乙醇。

3.一種快速檢測植物油中NOS終止子的方法，包括如下步驟：

1）根據NOS終止子基因序列設計特異性恒溫擴增檢測引物；

2）提取待檢植物油樣品的基因組DNA；

3）待檢樣品DNA在上述引物、Bst?DNA?聚合酶存在的條件下進行恒溫擴增反應；

4）根據擴增結果判斷待檢樣品中是否存在NOS終止子成分。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述恒溫擴增檢測引物的序列分別如下所示：

NOS-?F3：CTCGTTCAAACATTTGGCA（SEQ?ID?NO:1），

NOS-?B3：GCGCTATATTTTGTTTTCTATCG（SEQ?ID?NO:2），

NOS-FIP：ACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTG（SEQ?ID?NO:3）

NOS-BIP：TGCATGACGTTATTTATGAGATGGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGA（SEQ?ID?NO:4）。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟2）采取權利要求1的方法提取待檢植物油樣品的基因組DNA。

6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟3）所述恒溫擴增反應的體系為：25?μL?LAMP?反應體系含有1.6?μmol/L?NOS-FIP、1.6?μmol/L?NOS-BIP、0.2?μmol/L?NOS-F3、0.2?μmol/L?NOS-B3、1?mol/L甜菜堿、8?mmol/L?MgSO₄、8?U?Bst?DNA聚合酶、1.6?mmol/L?dNTP、2.5?μL?10×Thermo?pol?Buffer?及DNA模板2?μL；恒溫擴增反應的程序為：60～65℃恒溫反應45～60?min。

7.根據權利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，步驟4）可根據濁度法或染色法判斷檢測結果，其中，實時濁度法：利用實時濁度儀進行檢測，根據濁度曲線判斷結果，有擴增峰出現為陽性，無擴增峰出現為陰性；染色法：往反應液中加入熒光染料SYBR?Green?I，如果顏色變綠則為陽性，即待檢樣品中含有NOS終止子，如果顏色為橙色則為陰性。

8.一種用于快速檢測植物油中NOS終止子的LAMP試劑盒，其包括4條根據NOS終止子基因序列設計的特異性恒溫擴增檢測引物，所述恒溫擴增檢測引物的序列分別如下所示：

NOS-?F3：CTCGTTCAAACATTTGGCA（SEQ?ID?NO:1），

NOS-?B3：GCGCTATATTTTGTTTTCTATCG（SEQ?ID?NO:2），

NOS-FIP：ACATGCTTAACGTAATTCAACAGAAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTG（SEQ?ID?NO:3）

NOS-BIP：

TGCATGACGTTATTTATGAGATGGCGTATTAAATGTATAATTGCGGGA（SEQ?ID?NO:4）。