[發(fā)明專利]復(fù)合型納米疫苗及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310603297.6
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN104645349A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬軼凡;蔡林濤;劉蘭蘭;易虎強
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳先進技術(shù)研究院
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K39/39;A61K39/00;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 吳平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種以聚合物納米顆粒為載體的復(fù)合型納米疫苗及其制備方法。

背景技術(shù)

腫瘤疫苗介導(dǎo)的抗腫瘤免疫治療是繼手術(shù)、化療、和放療后的第四種抗腫瘤療法，主要利用腫瘤細胞的抗原物質(zhì)刺激機體產(chǎn)生特異性腫瘤細胞免疫殺傷，從而達到消滅腫瘤的目的。與傳統(tǒng)的抗腫瘤治療相比，腫瘤疫苗具有安全性好、特異性高等諸多優(yōu)點，目前已被廣泛用于治療肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤等各類惡性腫瘤，然而其臨床療效仍有待進一步提高。

樹突狀細胞（DC）作為體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞，是激發(fā)機體產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的首要核心環(huán)節(jié)。它能迅速攝取抗原，并將抗原信息通過MHCI類分子提呈給CD8+T淋巴細胞，使之活化成為細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic?Tlymphocyte,CTL），繼而殺死腫瘤細胞。此外，DC還通過分泌一系列細胞因子和趨化因子，進一步增強CTL介導(dǎo)的腫瘤細胞殺傷。然而，在腫瘤患者體內(nèi)，特別是在腫瘤組織中，成熟的DC數(shù)量減少且功能明顯降低，不能有效刺激機體T細胞活化。這一現(xiàn)象被認為是腫瘤細胞逃逸機體免疫監(jiān)視、誘導(dǎo)免疫耐受的重要機制之一。因此，誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的DCs（tumor-associated?DCs，TADCs）的成熟和活化，是提高腫瘤疫苗臨床療效的重要策略。

RNA干擾技術(shù)（RNAi）被認為是研究功能基因組最有力的工具之一。這種新興的生物技術(shù)為腫瘤分子水平的基因治療提供了新的技術(shù)和方法。RNAi是指通過雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)，特異性地降解靶mRNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象。它與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢。RNAi已作為一種簡單有效的基因敲除的技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究以及抗病毒、抗腫瘤治療的研究中。最近的研究表明，利用RNAi阻斷TADC的免疫抑制信號通路是克服免疫抑制的重要手段。文獻報道，利用RNAi技術(shù)降低DC細胞分泌抑制性因子（如IL-10和TGF-）的分泌，減少DC表面免疫抑制分子PD-L1的表達水平，顯著促進DC的抗原呈遞功能和抑瘤效果。然而，由于缺乏合適的載體，利用RNAi技術(shù)增強腫瘤疫苗的療效在體內(nèi)目前尚難得以實現(xiàn)。處于腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)樹突狀細胞（tumor-associated?dendritic?cells，TADCs）不但功能受到抑制，而且對免疫佐劑的刺激反應(yīng)低下，是制約腫瘤疫苗臨床療效的重要原因。目前尚無有效的手段可以活化TADCs，也缺乏高效安全的載體可將siRNA遞送到TADCs以阻斷其胞內(nèi)的免疫抑制性信號通路。

納米載體是指可以負載小分子藥物、基因和蛋白質(zhì)等目標(biāo)物質(zhì)且具有納米尺度的系統(tǒng)。其中，基于可降解高分子化合物的聚合物納米顆粒因其良好的生物相容性和安全性，被廣泛用于藥物、基因及疫苗載體。例如，聚氨基酸是一種由氨基酸組成的均聚物或共聚物，它的降解產(chǎn)物為氨基酸，是一種人體需要的成分，由于氨基酸的種類很多，可以通過選擇不同的氨基酸聚合可以得到各種性質(zhì)不同的聚氨基酸材料（親水、疏水、電正性、電負性等），所以聚氨基酸是一種非常有潛力的生物材料。

但是，現(xiàn)有的納米載體仍然存在許多不足，如多數(shù)納米載體穩(wěn)定性較差，生物相容性不是非常良好，不能在體內(nèi)完全降解和代謝，不能同時負載基因和蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)等，制備復(fù)雜且不能很好的控制納米載體的粒徑大小等，這些缺點的存在很大程度上限制了聚合物納米載體在制備納米疫苗中的應(yīng)用。例如，“納米疫苗及其制備方法”（CN?102068698A）提供了一種采用甘露糖基化的陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物作為疫苗載體，負載蛋白質(zhì)抗原，但該發(fā)明中的納米載體不能同時負載siRNA。又如，“一種樹突狀細胞靶向納米脂質(zhì)體瘤苗的制備工藝”（CN101690805A），該方案是將α1，3Gal糖脂引入到納米脂質(zhì)體表面，制備具有DCs靶向性的納米瘤苗脂質(zhì)體，活化DCs以增強抗腫瘤免疫反應(yīng)，但同樣地，該發(fā)明也不能聯(lián)合負載siRNA。另外，“一種高分子基因藥物載體及其制備方法和在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用”（公開號CN102512683A）使用環(huán)糊精羥丙基環(huán)糊精作為載體骨架，構(gòu)建帶正電荷的納米顆粒負載能夠抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長因子生成的siRNA進入腫瘤細胞；但是，該發(fā)明只用于基因治療，不能用于納米疫苗介導(dǎo)的免疫治療。

發(fā)明內(nèi)容

基于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種以性三嵌段共聚物為聚乙二醇衍生物-聚賴氨酸-聚亮氨酸的三嵌段聚合物同時負載腫瘤抗原、免疫佐劑和siRNA的復(fù)合型納米疫苗，具體技術(shù)方案如下：

一種復(fù)合型納米疫苗，包括以下組份：

腫瘤抗原：1-20重量份；