[發明專利]一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法

在審

• 申請號: 201310601670.4
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103604674A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 羅惠波;葉光斌;邊名鴻;衛春會;楊曉東;李丹宇
• 申請（專利權）人: 四川理工學院
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/34
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 吳彥峰

技術領域

本發明屬于食品加工工藝領域，涉及固態食品發酵產物中毒素的檢測方法，具體為一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法。

背景技術

赭曲霉毒素A是一種無色結晶化合物?？扇苡跇O性有機溶劑和稀碳酸氫鈉溶液。微溶于水。赭曲霉毒素A是由多種生長在糧食（小麥、玉米、大麥、燕麥、黑麥、大米和黍類等）、花生、蔬菜（豆類）等農作物上的曲霉和青霉產生的。動物攝入了霉變的飼料后，這種毒素也可能出現在豬和母雞等的肉中。赭曲霉毒素主要侵害動物肝臟與腎臟。這種毒素主要是引起腎臟損傷，大量的毒素也可能引起動物的腸黏膜炎癥和壞死。在動物試驗中還觀察到它的致畸作用。

近年來，食品安全已引起社會廣泛的關注。采用ELASA（酶聯免疫法）可以很快的檢測待測樣品中赭曲霉毒素含量。然而如何快速、有效的提取和純化毒素已成為制約該技術應用的瓶頸。應用本技術可以快速、準確提取大曲、酒醅、固態發酵法制備的食品樣品等中的赭曲霉毒素，用于后續的ELASA或液相色譜檢測。

酶聯免疫法是指利用抗原和抗體的免疫反應和酶的高效催化作用，在一定條件下呈現色澤反應，通過分光光度計對其進行定性定量測定。該方法有特異性強、靈敏度高、分析速度快等優點，可以快速的針對待測樣品中赭曲霉毒素A含量進行定性、定量檢測。

ELASA方法對待測樣品中赭曲霉毒素A含量進行定量檢測時精確度不高是一個長期困擾該方法推廣使用的主要問題，傳統意義上的使用免疫親和柱進行提取純化，效果雖好，但對設備要求高，步驟復雜，且價格昂貴、花費較高，因此如何簡便快捷、經濟有效的提取和純化毒素成為制約該技術應用的瓶頸。

通過比較赭曲霉毒素ELASA試劑盒內赭曲霉毒素提取效果和國標GBT25220-2010免疫親和柱法的提取效果，發現現有的ELASA試劑盒內赭曲霉毒素A提取效果比免疫親和柱純化法得到的赭曲霉毒素含量要低；而采用赭曲霉毒素免疫親和柱提取純化赭曲霉毒素無疑會大大增加檢測成本。因此通過對固態成品大曲樣品中赭曲霉毒素A提取、純化工藝的改進來解決這一問題非常必要。

發明內容

本發明正是針對以上技術問題，提供一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，該方法的檢測成本低，效果好，對設備要求低，步驟簡單且快捷。

本發明的具體技術方案如下：

①取一定量粉碎后的大曲樣品，置于離心管內，然后加入一定量的樣品提取液，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩；所述的樣品提取液為去離子水與甲醇按體積比為7:3的比例進行混合的液體，甲醇為色譜純；大曲樣品的質量：樣品提取液的體積=1:4，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩的時間為10min。

②采用離心機進行離心；所采用的離心機為4000rpm，離心時間為5min。

③取上清液，通過玻璃纖維濾紙進行過濾；

④準確量取一定量的過濾后液體于離心管內，加入三氯甲烷試劑，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩后再靜置；所述的三氯甲烷試劑為色譜純，過濾后的液體與三氯甲烷的體積比為1:1。在渦旋振蕩器上劇烈震蕩后再靜置，其劇烈震蕩的時間為5min，靜置10min

⑤待分層后，取下層三氯甲烷相于離心管內，在溫度為50℃的條件下用氮氣吹干；

⑥取色譜級甲醇于氮氣吹干后的離心管內，劇烈震蕩，溶解赭曲霉毒素A。最后0.5mL甲醇中赭曲霉毒素A的含量與0.5g大曲中的含量相等。

本發明的積極效果體現在：

（一）、提取成本低，效果好，提取和純化率高；

（二）、對設備要求低，步驟簡單且快捷；

（三）、本提取和純化的方法比較省時，國標法由于需要親和柱純化法，至少需要4-6的時間，而本方法僅需要半小時左右的時間。

附圖說明

圖1為赭曲霉毒素A標準品梯度稀釋后繪制的標準曲線。從圖1可以看出，相關系數達到0.9994，且變異率小于10%，符合實驗要求。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合具體實施方式對本發明作進一步的詳細描述，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于下述實施例。

實施例1：

一種大曲中赭曲霉毒素A的提取、純化方法，具體包括以下步驟：

①取5g粉碎后的大曲樣品，置于50ml的離心管內，然后加入20ml的樣品提取液，在渦旋振蕩器上劇烈震蕩10min；樣品提取液為去離子水與甲醇按體積比為7:3的比例進行混合的液體，甲醇為色譜純，大曲樣品的質量：樣品提取液的體積=1:4。