[發明專利]檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法

在審

• 申請號: 201310601573.5
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103743902A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 姚登福;陳潔;姚敏;王理
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/535;C12N15/85
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

技術領域

本發明涉及GPC-3相關基因技術，特別涉及一種檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法。

背景技術

磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(glypican-3,GPC-3)作為一種細胞表面蛋白，在肝細胞癌（hepatocellular?carcinoma,HCC）中特異性高表達，被認為是肝癌早期診斷及特異性治療的潛在靶點。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（GPC-3）屬于糖基磷脂酰肌醇錨定的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族。GPC-3基因定位于人染色體X26.10，因為該分子的突變或者異常表達常與疾病相關，所以受到廣泛關注。現有技術當中，基于沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤研究沒有簡單高效的手段，沉默GPC-3基因轉錄對肝癌裸鼠移植瘤的能力的驗證不夠簡便。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，方法包括如下步驟：

1）針對靶基因human?GPC3,Gene?ID:2719的4個轉錄本的共有序列設計并合成4對miRNA寡聚單鏈DNA,再合成相應dsDNA，將dsDNA插入載體構建4種GPC-3-miRNA重組質粒，并通過熒光定量PCR挑選出干擾效率最高的一種GPC-3-miRNA重組質粒；

2）將上述干擾效率最高的重組質粒轉染至HepG2細胞中構建轉染HepG2細胞，并對其進行篩選，得到穩定轉染HepG2細胞;

3）將上述穩定轉染HepG2細胞接種裸鼠皮下構建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型；

4）而后測定上述穩定轉染HepG2細胞在人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型中生長情況。

在一些實施方式中，4種的GPC-3-miRNA重組質粒分別為：

p-CMV-GPC-3-miRNA-1；

p-CMV-GPC-3-miRNA-2；

p-CMV-GPC-3-miRNA-3；

p-CMV-GPC-3-miRNA-4;

p-CMV-GPC-3-miRNA-1插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為

F:5-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAGAACTAATTCA-3

R:5-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAATTCAC-3

p-CMV-GPC-3-miRNA-2插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為

F:5-TGCTGTAATTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAAATTA-3

R:5-CCTGTAATTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCAGTGGTCAGTCAAATTAC-3

p-CMV-GPC-3-miRNA-3插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為

F:5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTAATGAA-3

R:5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATCTATACCCAGCTAATGAAC-3

p-CMV-GPC-3-miRNA-4插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為

F:5-TGCTGAATACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGACGTGCTGAAAGTATT-3

R:5-CCTGAATACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGACGTGACCTGAAAGTATTC-3

在一些實施方式中，干擾效率最高的重組質粒為：

p-CMV-GPC-3-miRNA-1。

在一些實施方式中，載體為pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR。

在一些實施方式中，干擾效率最高的重組質粒轉染至HepG2細胞中構建轉染HepG2細胞中使用GenjetTM轉染試劑，得到穩定轉染HepG2細胞使用的篩選用試劑為殺稻瘟菌素。