[發明專利]檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法

在審

• 申請號: 201310601573.5
• 申請日: 2013-11-25
• 公開（公告）號: CN103743902A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發明（設計）人: 姚登福;陳潔;姚敏;王理
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/535;C12N15/85
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

1.檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，該方法包括如下步驟：?

1）針對靶基因human?GPC3,Gene?ID:2719的4個轉錄本的共有序列設計并合成4對miRNA寡聚單鏈DNA,再合成相應dsDNA，將dsDNA插入載體構建4種GPC-3-miRNA重組質粒，并通過熒光定量PCR挑選出干擾效率最高的一種GPC-3-miRNA重組質粒；?

2）將上述干擾效率最高的重組質粒轉染至HepG2細胞中構建轉染HepG2細胞，并對其進行篩選，得到穩定轉染HepG2細胞;?

3）將上述穩定轉染HepG2細胞接種裸鼠皮下構建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型；?

4）而后測定上述穩定轉染HepG2細胞在人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型中生長情況。?

2.根據權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，4種所述GPC-3-miRNA重組質粒分別為：?

p-CMV-GPC-3-miRNA-1、p-CMV-GPC-3-miRNA-2、p-CMV-GPC-3-miRNA-3和p-CMV-GPC-3-miRNA-4;?

p-CMV-GPC-3-miRNA-1插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為?

F:5-TGCTGTGAATTAGTTCCCTTCTTCGGGTTTTGGCCACTGACTGACCCGAAGAAGAACTAATTCA-3?

R:5-CCTGTGAATTAGTTCTTCTTCGGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCCGAAGAAGGGAACTAATTCAC-3?

p-CMV-GPC-3-miRNA-2插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為?

F:5-TGCTGTAATTTGACTGACCACTGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCAGTGCAGTCAAATTA-3?

R:5-CCTGTAATTTGACTGCACTGGCTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAGCCAGTGGTCAGTCAAATTAC-3?

p-CMV-GPC-3-miRNA-3插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為?

F:5-TGCTGTTCATTAGCTGGGTATAGATGGTTTTGGCCACTGACTGACCATCTATACAGCTAATGAA-3?

R:5-CCTGTTCATTAGCTGTATAGATGGTCAGTCAGTGGCCAAAACCATCTATACCCAGCTAATGAAC-3?

p-CMV-GPC-3-miRNA-4插入序列正、反義鏈（5’-3’）分別為?

F:5-TGCTGAATACTTTCAGGTCACGTCTTGTTTTGGCCACTGACTGACAAGACGTGCTGAAAGTATT-3?

R:5-CCTGAATACTTTCAGCACGTCTTGTCAGTCAGTGGCCAAAACAAGACGTGACCTGAAAGTATTC-3?。?

3.根據權利要求2所述一種檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述干擾效率最高的GPC-3-miRNA重組質粒為p-CMV-GPC-3-miRNA-1。?

4.根據權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述載體為pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR。?

5.根據權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，?

所述干擾效率最高的重組質粒轉染至HepG2細胞中構建轉染HepG2細胞中使用Genjet^TM轉染試劑，所述得到穩定轉染HepG2細胞使用的篩選用試劑為殺稻瘟菌素。?

6.根據權利要求1所述一種檢測沉默GPC-3基因轉錄抑制肝癌裸鼠移植瘤能力的方法，所述步驟（3）中轉染HepG2細胞接種裸鼠皮下構建人肝癌細胞荷瘤裸鼠模型的方法為：收集對數生長期的轉染HepG2細胞，以2×10⁷／(0.2ml·只)接種于裸鼠右肩胛部皮下，形成直徑4mm左右的皮下隆起。?