[發明專利]犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條及制備方法

無效

• 申請號: 201310600672.1
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN103604924A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 劉潔;牟林琳;廖園園;何文輝;王威;漆世華;朱薇;溫文生;謝紅玲;馮釗
• 申請（專利權）人: 武漢中博生物股份有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

1.一種犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于：包括樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區、吸水區和底板，樣品吸收區、金標探針區、固相化抗體區和吸水區依次鋪設在底板上并相互部分重疊；金標探針區包被有膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體F1；固相化抗體區依次有檢測線和對照線，檢測線包被有抗犬細小病毒單克隆抗體B6；對照線包被有羊抗小鼠IgG；所述的抗犬細小病毒單克隆抗體F1和B6由抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株F1和B6產生，抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株F1和B6保藏編號分別為CCTCC?NO：C2013175和CCTCC?NO：C2013176。

2.根據權利要求1所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于：所述的膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體F1的標記量為1～10μg/mL；所述的抗犬細小病毒單克隆抗體B6的包被量為0.1～10μg/cm；所述的羊抗小鼠IgG的為0.1～10μg/cm。

3.根據權利要求1所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條，其特征在于：所述的底板的材料為聚乙烯板；所述的樣品吸收區的材料為玻璃纖維膜；所述的金標探針區的材料為聚酯膜；所述的固相化抗體區的材料為硝酸纖維素膜；所述的吸水區的材料為吸水濾紙。

4.權利要求1-3任一項所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括如下步驟：將膠體金標記的抗犬細小病毒單克隆抗體F1噴涂于聚酯膜上；在硝酸纖維素膜上依次包被檢測線和對照線；將玻璃纖維膜、包被有抗犬細小病毒單克隆抗體F1的聚酯膜、包被有檢測線和對照線的硝酸纖維素膜、和吸水濾紙組裝到聚乙烯板上得到犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條。

5.根據權利要求4所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）抗犬細小病毒單克隆抗體的制備：選8～10周齡體重20g以上的雌性BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5mL降植烷，7天后腹腔分別注射抗犬細小病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株F1和B6，接種量為2×10⁶～4×10⁶細胞/0.5mL/只，經過一周，待小鼠腹部膨大后抽取腹水，5000rpm離心15min，取上清備用；將腹水用50%飽和度的硫酸銨鹽析2次，透析除鹽即得純化的抗犬細小病毒單克隆抗體F1和抗犬細小病毒單克隆抗體B6；

（2）膠體金標記抗犬細小病毒單克隆抗體F1的方法：分別取半徑為5～40nm的膠體金20mL及抗犬細小病毒單克隆抗體F1?50～200μg，在pH?8.0～9.0的條件下通過磁力攪拌振蕩使其結合，加PEG-20000作為穩定劑，且使得PEG-20000最終質量濃度為10～20%，采用離心法除去未結合的抗犬細小病毒單克隆抗體F1和未穩定的膠體金顆粒及其凝集物，在離心管底部的深紅色沉淀為膠體金-F1復合物；

（3）將膠體金-F1復合物噴涂于聚酯膜上：用20mL聚乙二醇洗滌膠體金-F1復合物，離心除去上清液，得到深紅色沉淀，純化后的沉淀用2mL濃度為2mmol/L、pH?6.0～8.0的硼酸緩沖液溶解，用噴涂設備涂于聚酯膜上15μL/cm，凍干；

（4）硝酸纖維素膜的包被：檢測線包被的是抗犬細小病毒單克隆抗體B6，包被量為0.1～10μg/cm，對照線包被的是羊抗小鼠IgG，包被量為0.1～10μg/cm，每條線寬2～5mm；

（5）試紙條制備：將玻璃纖維膜、包被膠體金-F1復合物的聚酯膜、包被檢測線和對照線的硝酸纖維素膜和吸水濾紙依次粘附于聚乙烯板上，將組裝好的試紙條縱向切成4mm的條狀即為犬細小病毒膠體金免疫層析試紙條。

6.權利要求1-3任一項所述的犬細小病毒膠體金免疫層析檢測試紙條的使用方法，其特征在于包括如下步驟：檢測時，用無菌棉簽沾取待檢動物的糞便樣品，在PBS緩沖液中混勻，待大顆粒沉于管底后，取上清滴在該試紙條樣品吸收區，5～10分鐘后判讀結果，對比檢測線和對照線的顏色，即可判定被檢動物體內是否帶有犬細小病毒或感染犬細小病毒。