[發(fā)明專利]一種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310600169.6
• 申請(qǐng)日: 2013-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN103675291A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳紅兵;朱曉燕;吳志華;高金燕;袁娟麗;李欣;佟平;楊安樹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南昌大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/577;G01N1/28
• 代理公司: 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司 36115
• 代理人: 施秀瑾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明所屬領(lǐng)域主要為食品和生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法。

背景技術(shù)

乳糜瀉是一種遺傳易感者對(duì)小麥、黑麥和大麥麩質(zhì)蛋白不耐受而引發(fā)的慢性腸炎疾病。它在歐美發(fā)病率達(dá)1-2%，且全球呈上升趨勢(shì)。該病目前無有效療法，嚴(yán)格的無麩質(zhì)飲食是患者唯一的治療方式。但由于市面上無麩質(zhì)食品少且質(zhì)量良莠不齊，同時(shí)很多并不含有麩質(zhì)的食品也有可能在加工過程中混入麩質(zhì)，嚴(yán)重影響了乳糜瀉患者的生活。因此，篩查低乳糜瀉毒性小麥品種具有重大的意義。

麩質(zhì)蛋白主要包括單體的麥醇溶蛋白（α/β、γ、ω-醇溶蛋白）和多聚體的麥谷蛋白（高分子量麥谷蛋白和低分子量麥谷蛋白）。二者含有大量的脯氨酸和谷氨酰胺，含少量精氨酸、賴氨酸和組氨酸。麥醇溶蛋白主要溶解于醇溶液，麥谷蛋白溶解于含還原劑的醇溶液。由于麩質(zhì)蛋白氨基酸種類和含量的特殊性，導(dǎo)致其不同于普通的食物蛋白，常規(guī)的各種方法對(duì)于麩質(zhì)蛋白的研究并不適用。

引發(fā)乳糜瀉的是麩質(zhì)蛋白上的某些T細(xì)胞表位，這些表位不僅存在于麥醇溶蛋白上，也存在于麥谷蛋白上。麩質(zhì)蛋白的高效分離提取對(duì)于致乳糜瀉T細(xì)胞表位的鑒定至關(guān)重要。目前，關(guān)于小麥麩質(zhì)蛋白的提取方法主要有60%的乙醇法和50%異丙醇結(jié)合DTT一步法。60%乙醇提取法是使用最早也較普遍的一種提取方法，但該法對(duì)于同樣存在致乳糜瀉表位的麥谷蛋白提取效率不高，有研究報(bào)道60%乙醇提取法可從每克小麥中提取麩質(zhì)蛋白0.01g，濃度為0.33mg/mL。而50%異丙醇結(jié)合DTT的一步法由于加入了還原劑DTT，因而對(duì)于麥谷蛋白的提取效率大大提高了，可從每克小麥中提取麩質(zhì)蛋白0.03g，該法提取的麩質(zhì)蛋白濃度為1.01mg/ml?。但一步提取法對(duì)ω-醇溶蛋白和D-型低分子量蛋白的提取效率不高，現(xiàn)有報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該法提取的麩質(zhì)蛋白中這兩種蛋白會(huì)有很大程度的缺失。

提取的麩質(zhì)蛋白通過SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠）電泳進(jìn)行鑒定，常規(guī)SDS-PAGE膠的染色方法主要有考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色法和銀染等。由于麩質(zhì)蛋白具有非典型的氨基酸組成，因而不同的染色條件對(duì)麩質(zhì)蛋白的鑒定有不同程度的偏差。其中傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)（R-250）染色法主要與賴氨酸和精氨酸殘基反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度為8-16?ng，且該法操作簡單。但是傳統(tǒng)考馬斯亮藍(lán)染色后的麩質(zhì)蛋白，在脫色過程中，蛋白會(huì)不同程度地被洗脫，特別是ω-醇溶蛋白和低分子量麥谷蛋白，有些蛋白甚至?xí)笔Аｃy染靈雖然敏度較高，為4-8?ng，但操作程序復(fù)雜，且容易染色過度。研究發(fā)現(xiàn)，銀染對(duì)高分子量麥谷蛋白的染色效果也較差，如若延長染色時(shí)間又容易造成其他蛋白的染色過度。

現(xiàn)有的用于檢測(cè)小麥麩質(zhì)蛋白的方法有ELISA法，免疫印跡法和質(zhì)譜法。ELISA法需要采用特定的試劑盒，成本較高。目前市售的試劑盒主要是基于R5單抗和Skerritt?抗體。這兩種抗體都只是檢測(cè)醇溶蛋白的，而對(duì)于同樣存在乳糜瀉毒性的麥谷蛋白不能檢測(cè)出。免疫印跡法原理同ELISA法一致，但該法對(duì)抗體的選擇比較自由，不再局限于針對(duì)醇溶蛋白的抗體，而是可以結(jié)合針對(duì)致乳糜瀉T細(xì)胞表位的抗體，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、直觀。質(zhì)譜分析具有靈敏度高、樣品用量少、質(zhì)量精度高且結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，但與免疫學(xué)檢測(cè)方法相比，質(zhì)譜法依賴貴重設(shè)備，費(fèi)用較高、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適用于食品行業(yè)現(xiàn)的場(chǎng)快速、大量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是建立一種基于T細(xì)胞表位篩查低乳糜瀉毒性小麥品種的方法，具體提供分離提取麩質(zhì)蛋白的兩步法、麩質(zhì)蛋白鑒定的SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝膠）電泳結(jié)合PageBlue^TM染色法和麩質(zhì)蛋白致乳糜瀉T細(xì)胞表位鑒定的免疫印跡法。不僅可以應(yīng)用于篩查低乳糜瀉毒性小麥品種，還可應(yīng)用于篩查低乳糜瀉毒性的大麥、黑麥以及燕麥品種。該法檢測(cè)結(jié)果清晰、全面、直觀。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

本發(fā)明具體步驟如下。

1、麩質(zhì)蛋白的提取和鑒定。