[發明專利]一種雷公藤內酯醇衍生物的制備方法及其產物和應用

有效

• 申請號: 201310598500.5
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103627772B
• 公開（公告）日: 2017-01-04
• 發明（設計）人: 張景紅;謝深霞;唐圓圓
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12P33/20
• 分類號: C12P33/20;C07J73/00;A61P35/00;A61P35/02;A61P31/18;A61P31/20;A61P1/16;A61P31/22;A61P31/16;C12R1/685;C12R1/67;C12R1/785;C12R1/80
• 代理公司: 泉州市文華專利代理有限公司35205
• 代理人: 戴中生

1.一種雷公藤內酯醇衍生物的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一：取保存于4℃、土豆斜面培養基培養的、轉化菌種一支，置于25℃恒溫培養箱中培養7天后，以適量無菌水將斜面上的孢子充分吹打下來，使單孢子懸液的濃度調整至10⁷～10⁸個/mL，既得種子孢子液；

步驟二：以100ml，5mL的接種量，在土豆液體培養基上接種步驟一所得孢子液，在pH至6.0，溫度30℃±1℃，振蕩速度為200r/min條件下培養12h后；按0.1～4ug的接種量，加入各種不同比例的聯合誘導子，繼續培養12h后，再按1～10ug的接種量加入雷公藤內酯醇，然后繼續培養5天，每天檢測各種雷公藤內酯醇衍生物的含量和轉化率，當產物轉化率低至0.5～3%時，停止培養，過濾后收集菌絲體，然后將濾液于8000r/min,離心10min去除沉淀既得到發酵提取液；

步驟三：將步驟二所得提取液過濾，濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3遍，合并萃取液；而菌絲體則用重量比為1：3～1：10的乙酸乙酯超聲提取30min，然后濾去菌絲體，所得濾液與萃取液合并，既得分離提取液，提取液濃縮至干，得到提取后殘渣；

步驟四：將經過步驟三處理所得的殘渣，用1mg：1～10mL的比例用丙酮溶解后，采用硅膠拌樣后揮干，稱取20倍于樣品量的硅膠，使用濕法進行填柱和上樣；首先用5倍柱體積的100%石油醚將樣品中低極性油類物質洗脫干凈，然后依次用體積比為：10:1，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2，1:4，1:6，1:8的石油醚：乙酸乙酯洗脫液，依次對柱子進行洗脫，最后用100%乙酸乙酯再洗脫柱子，TLC控制收集主餾分，最后使用旋轉蒸發儀將各個餾分的流動相蒸干后，用適量色譜純的甲醇溶解后，用0.22μm的有機膜過濾后，得到分離液；

步驟五：將經過步驟四處理所得的分離液，采用高效液相半制備法分離純化，HPLC梯度洗脫法控制收集不同的雷公藤內酯醇衍生物洗脫液，減壓蒸去溶劑后，用甲醇結晶后所得到的化合物，即為所述的雷公藤內酯醇衍生物。

2.如權利要求1所述的一種雷公藤內酯醇衍生物的制備方法，其特征在于：

所述的土豆培養基為：土豆200g/L，葡萄糖20g/L；配置時將土豆去皮后將其切成小塊，加水加熱煮沸30min，過濾，取濾液定容至1L，加入葡萄糖20g，攪拌溶解后，121℃滅菌30min，即得；斜面培養基為：取上述土豆培養基1L，加入瓊脂粉各20g，加熱溶解后分裝于玻璃試管中，于121℃下滅菌30min后取出，傾斜45度，靜置、冷卻既得。