[發明專利]胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白4疫苗及其制備和應用

有效

• 申請號: 201310593368.9
• 申請日: 2013-11-23
• 公開（公告）號: CN103705920A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發明（設計）人: 袁邦清;陳羽建;沈汗超;林立;吳賢群
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍南京軍區福州總醫院四七六醫院
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K48/00;A61K9/127;A61P35/00;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白4的免疫增強型疫苗，還涉及該疫苗的制備方法和用途。

背景技術

腦膠質瘤是人體中樞神經系統最常見的腫瘤，盡管采取了多種方法進行積極治療，但是預后仍不夠理想。胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白(?cytoplasmic?polyadenylation?element-binding?proteins，CPEBs)?是一組介導mRNA?胞質多聚腺苷酸化和翻譯的RNA?結合蛋白。近年來，人們發現其在大多數腫瘤細胞中有異常表達現象。隨著CPEBs?與腫瘤關系的研究開展，國外已有研究報道CPEB4?在膠質母細胞瘤中呈陽性表達，并且其陽性率與腫瘤惡性程度的呈正相關。因此，CPEB4有望成為膠質瘤的一個新的治療靶點。

BAFF?是B?細胞存活與成熟的必需因子,也被稱為腫瘤壞死因子和凋亡配體相關的白細胞表達配體,為TNF?家族成員,是Ⅱ型跨膜蛋白,N?末端在胞內無信號肽,C?末端為胞外區,其中47～73?位氨基酸為跨膜區,74～285?位氨基酸為胞外區,133～285?位氨基酸為其發揮功能的主要區域,128～285?位氨基酸殘基區域含有與受體結合的結構域。BAFF?有膜結合蛋白和可溶性配體(hsBAFF)?兩種形式存在。hsBAFF?能夠增強B?細胞、CD4?T?細胞、N?K?細胞的活性,?使機體的免疫應答增強。BAFF?不僅是B?細胞的存活因子,還對T?細胞激活有共刺激作用。T?細胞和樹突狀細胞表達的BAFF?可作為T?細胞激活的共刺激因子,人重組或內源BAFF?刺激T?細胞分泌IFN-γ和IL-2?,上調CD25?(?IL22?受體α鏈)?表達,并以IL-2?依賴方式促進T?細胞增生。

免疫刺激復合物(?ISCOM)?是一種新型的蛋白質疫苗佐劑,可增強蛋白質抗原誘導體液和細胞免疫應答,包括抗體的產生、遲發性超敏反應、細胞毒性T?細胞的激活等。ISCOM?與裸DNA?混合制備DNA?疫苗誘導的中和抗體水平和免疫保護力，明顯高于單獨使用裸DNA?,說明ISCOM?還具有增強DNA?疫苗免疫效果的作用?？赡艿臋C制是經ISCOM?包裹的DNA?能免受體內核酸酶的降解,?從而保證DNA?疫苗在雞體內的持續表達。另外,?ISCOM的結構特性使其更易于定居在淋巴組織內,有利于APC?吞噬ISCOM-DNA?復合物。ISCOM?具有制備簡單、價格低廉等優點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白4疫苗及其制備方法，以及基于此疫苗的應用，為膠質瘤的治療提供新的治療策略。

為了實現上述目的，本發明采取的技術方案如下：

一種胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白4疫苗為ISCOM-DNA?復合物，每毫升中含有0.?1mg膽固醇、0.?1mg?卵磷脂、1mg?QuilA和0.?5mg?質粒pStar-CPEB4?/BAFF。

一種胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白4疫苗的制備方法，包括以下步驟：

（1）胞質多聚腺苷酸化成分結合蛋白4全長cDNA的克隆

從膠質瘤細胞提取總RNA，然后逆轉錄為cDNA，以該總cDNA為模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg?-3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’為上下游引物進行PCR擴增，擴增條件為：94℃預變性3分鐘，然后94℃變性1分鐘、58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個循環，最后72℃延伸7分鐘。

（2）腫瘤壞死因子BAFF全長cDNA的克隆

提取人脾臟組織總RNA，反轉錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacagaaagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’為上下游引物，PCR擴增BAFF全長cDNA，擴增條件為：94℃預變性5分鐘，然后94℃變性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分鐘，共30個循環；最后72℃延伸10分鐘。

（3）重組載體pStar-CPEB4?/BAFF的構建

將CPEB4?全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，再將BAFF全長cDNA插入pStar載體的IRES下游。

（4）pStar-CPEB4?/BAFF工程菌的構建

將CPEB4?原核表達載體pStar-CPEB4?/BAFF用SalⅠ酶切使線性化，用電穿孔法轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，獲得高拷貝CPEB4?工程菌。

（5）CPEB4?的誘導表達