[發(fā)明專利]胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗及其制備和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310593368.9
• 申請日: 2013-11-23
• 公開（公告）號: CN103705920A
• 公開（公告）日: 2014-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁邦清;陳羽建;沈汗超;林立;吳賢群
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院四七六醫(yī)院
• 主分類號: A61K39/39
• 分類號: A61K39/39;A61K48/00;A61K9/127;A61P35/00;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗，其特征在于：該疫苗為ISCOM-DNA?復(fù)合物，每毫升中含有0.?1mg膽固醇、0.?1mg?卵磷脂、1mg?QuilA和0.?5mg?質(zhì)粒pStar-CPEB4?/BAFF。

2.一種如權(quán)利要求1所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4全長cDNA的克??；

（2）腫瘤壞死因子BAFF全長cDNA的克?。?/p>

（3）重組載體pStar-CPEB4?/BAFF的構(gòu)建：將CPEB4?全長cDNA插入pStar載體的IRES上游，再將BAFF全長cDNA插入pStar載體的IRES下游；

（4）pStar-CPEB4?/BAFF工程菌的構(gòu)建：將CPEB4?原核表達(dá)載體pStar-CPEB4?/BAFF用SalⅠ酶切使線性化，用電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，獲得高拷貝CPEB4?工程菌；

（5）CPEB4?的誘導(dǎo)表達(dá)：用甲醇誘導(dǎo)工程菌表達(dá)CPEB4，并進(jìn)行分離純化，得到高純度的CPEB4；

（6）ISCOM-DNA?復(fù)合物的制備。

3.如權(quán)利要求2所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟（1）從膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該總cDNA為模板，以F1：5’-aatctgcagatgggggattacgg?-3’，R1：5’-tacgaattcgctggaactaa-3’為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3分鐘，然后94℃變性1分鐘、58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7分鐘。

4.如權(quán)利要求2所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟（2）提取人脾臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到總cDNA，再以該總cDNA為模板，以F2：5’-gatcggatccatggatgactccacaga?aagg-3’和R2：5’-acgcgtcgactcacagcagtttcaatgcac-3’為上下游引物，PCR擴(kuò)增BAFF全長cDNA，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5分鐘，然后94℃變性50秒，58℃退火50秒，72℃延伸2分鐘，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。

5.如權(quán)利要求2所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟（5）純化的方法為：培養(yǎng)上清液加入質(zhì)量百分濃度為80%的硫酸銨使蛋白質(zhì)沉淀，離心棄上清，蛋白質(zhì)沉淀用濃度為0.02mol/L、pH為8.0的磷酸鹽緩沖液透析脫鹽，再用瓊脂糖凝膠Q-Sepharose柱進(jìn)行分離純化，用濃度為1mol/L的氯化鈉溶液線性梯度洗脫，收集含有CPEB4?的洗脫液，適當(dāng)濃縮后用葡聚糖凝膠Sephdex?G-25柱脫鹽。

6.如權(quán)利要求2所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗的制備方法，其特征在于：所述的步驟（6）0.1mg/ml膽固醇、0.1mg/ml?卵磷脂、1mg/ml?QuilA和0.5mg/ml?質(zhì)粒pStar-CPEB4?/BAFF?,反復(fù)混勻并充分乳化使溶液完全清晰,?混合物經(jīng)透析后形成微絮狀物即ISCOM-DNA?復(fù)合物。

7.一種如權(quán)利要求1~6所述的胞質(zhì)多聚腺苷酸化成分結(jié)合蛋白4疫苗在神經(jīng)膠質(zhì)瘤防治中的應(yīng)用。