[發明專利]一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法

無效

• 申請號: 201310592905.8
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN103555681A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 龐代文;文莉;林毅;張志凌;王漢中
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

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技術領域

本發明屬于化學和生物醫學領域，涉及一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法。

背景技術

病毒侵染細胞機制研究對預防和治療病毒引起的疾病至關重要，對活病毒的熒光標記可以為研究病毒侵染機制提供重要基礎。傳統的熒光標記物往往存在易光漂等缺點，而半導體熒光量子點具有獨特的光學性能，如熒光量子產率高、激發光譜寬、發射光譜窄等，因此近年來出現了許多采用量子點標記病毒的方法。包膜病毒廣泛存在于自然界并且與人類健康密切相關，因此在相關研究中受到極大關注。然而，目前還只能實現量子點對包膜病毒表面包膜的標記，可能干擾病毒對細胞受體的識別及影響病毒的侵染活性，因此采用量子點標記包膜病毒內部的核衣殼是一種更優選擇。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于針對現有技術的不足提供一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法。

本發明利用包膜病毒基因組允許外源基因插入和在宿主細胞內自我復制的特點，構建了重組病毒基因組質粒。將這種質粒轉染其宿主細胞，核衣殼能夠在病毒組裝過程中被生物素化并出芽帶上包膜，從而獲得帶有生物素化核衣殼的重組包膜病毒。利用生物素和鏈霉親和素的相互作用，用偶聯有鏈酶親和素的量子點標記重組病毒，實現量子點對活包膜病毒核衣殼的標記（如圖1所示）。

本發明方法具體包括如下步驟：

1.???將融合了生物素受體肽序列的衣殼蛋白序列和催化受體肽生物素化的酶序列同時插入到病毒全基因組，得到重組病毒質粒；

2.???用重組病毒質粒轉染宿主細胞，細胞全部出現病變時收集細胞上清液并純化和濃縮得到重組病毒；

3.???將重組病毒與細胞裂解液孵育至病毒液開始由渾濁變澄清，得到脫去部分包膜的病毒；

4.???將偶聯有鏈酶親和素的量子點與部分脫膜的重組病毒孵育以標記病毒，純化得到核衣殼標記了量子點的包膜病毒。

對標記了量子點的病毒的純化通過蔗糖密度梯度離心實現。

所述的酶序列為BirA酶序列。

本發明的實施例中，使用的包膜病毒為桿狀病毒，宿主細胞為Sf9細胞。

將濃縮的重組桿狀病毒在含有0.8%?NP40的10?mM?pH?8.5的Tris緩沖溶液中孵育15min，得到脫去部分包膜的桿狀病毒。

將2?nM?偶聯有鏈霉親和素的量子點（SA-QDs）與脫去部分包膜的重組桿狀病毒在4°C下孵育30分鐘，即可實現量子點對重組桿狀病毒核衣殼的標記。

本發明借助病毒在宿主細胞內的自我復制過程實現病包膜毒核衣殼的生物素化，繼而用偶聯有鏈酶親和素的量子點進行反應，從而實現了量子點對包膜病毒核衣殼的標記。所構建的重組病毒可以作為毒種長期保存，通過簡單擴增就可以得到子代病毒并直接用于標記。與其它的包膜病毒標記方法相比，本發明方法更加溫和，無需通過劇烈的化學反應改造和標記病毒，保持了包膜病毒本身的侵染活性，且病毒內部核衣殼的標記不干擾包膜病毒表面對細胞受體的識別，有利于病毒對細胞的侵染過程的研究。

附圖說明

圖1為量子點標記病毒核衣殼的流程示意圖。

圖2為證明病毒核衣殼被生物素化的western?blot圖。

圖3為重組桿狀病毒被標記上量子點（A）及野生型病毒未被標記上量子點（B）的透射電子顯微鏡圖，標尺為100?nm。

圖4為標記了量子點的重組桿狀病毒QDs-RBV和野生型桿狀病毒WBV的一步生長曲線比較圖。

圖5為吸附在細胞表面的病毒與量子點的免疫熒光共定位圖，標尺為10?μm。

具體實施方式

以下實施例僅用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。

實施例1量子點標記重組桿狀病毒核衣殼

下面以桿狀病毒核衣殼的量子點標記為例，對本發明方法進行詳細的說明。

一、方法

1.?重組桿狀病毒質粒的構建：利用桿狀病毒表達系統，在桿狀病毒全基因組里同時插入VP39AP序列（融合了生物素受體肽AP序列的桿狀病毒衣殼蛋白VP39序列）和能夠催化AP生物素化的BirA酶序列，從而得到具有重組桿狀病毒全基因組的質粒。