[發明專利]一種定量檢測絲氨酸的方法

有效

• 申請號: 201310591734.7
• 申請日: 2013-11-22
• 公開（公告）號: CN103674873A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發明（設計）人: 繆劉;許首芳;余琳;王軼雄
• 申請（專利權）人: 杭州利安生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

技術領域

本發明屬于氨基酸檢測領域，涉及胱硫醚裂解酶法對絲氨酸的定量分析，是試劑檢測領域。

背景技術

絲氨酸是一種不帶電荷的極性氨基酸，白色結晶體或結晶性粉末，呈六角形片或柱狀晶，易溶于水和甲酸，難溶于乙醇。絲氨酸是一種非必需氨基酸，它在脂肪和脂肪酸的新陳代謝及肌肉的生長中發揮著作用，并且它有助于免疫血球素和抗體的產生，所以絲氨酸在維持健康的免疫系統方面扮演者重要的角色。絲氨酸是合成嘌呤、胸腺嘧啶、膽堿的前體，可用于生化研究。絲氨酸廣泛用于配置第三代復方氨基酸輸液和營養增補劑，并用于合成多種絲氨酸衍生物，如心血管、抗癌、艾滋病新藥及基因工程用保護氨基酸等。此外，絲氨酸具有穩定滴眼液pH值的作用，且滴眼后無刺激性。在化妝品行業中，絲氨酸是一種重要的自然保濕因子(NMF)?之一，它能有效保持皮膚角質層的水分，因此是很多高級化妝品中的關鍵添加劑。2012年12月，英國Beatson癌癥研究所的研究人員在一項新研究中證實，絲氨酸是癌細胞相關的一種關鍵氨基酸，可顯著削弱癌細胞的生長和增殖能力。

目前，國內外用來檢測氨基酸含量的方法，通常有高效液相色譜法、氨基酸自動分析儀法和紙層析-茚三酮顯色法。前兩種方法或者儀器設備要求高或者衍生步驟繁瑣，操作很不方便，而且對于樣品多、工作量大的絲氨酸分離提取以及絲氨酸產生菌的篩選來說并不適用。紙層析-茚三酮顯色法雖然操作方便、所用儀器較簡單，但在氨基酸種類復雜的環境中，對絲氨酸的層析分離和定量分析不夠準確。

絲氨酸在胱硫醚裂解酶（CBL）的作用下可以生成丙酮酸，丙酮酸測定的反應是乳酸測定的逆反應。在pH7.4條件下，平衡常數非常有利于逆反應（生成乳酸的方向）。通過測定340nm波長處NADH的下降速率，定量丙酮酸含量。此方法優點較多：順向反應中以NAD⁺、乳酸為底物都比較穩定，過量乳酸對乳酸脫氫酶（LD）的抑制作用小于過量丙酮酸；逆向反應NADH的用量只有正向反應NAD⁺的3%，酶促反應速率快于正向反應，所以應用樣品量少且可在短時間內完成測定。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的是提供一種定量檢測絲氨酸的方法。

定量檢測絲氨酸的方法，絲氨酸樣品經過胱硫醚裂解酶（CBL）作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸，通過測定生成丙酮酸的含量，定量得到樣品中絲氨酸的含量。

優選地，所述的丙酮酸的含量的測定方法為乳酸脫氫酶法，丙酮酸和NADH在LD，pH7.4，作用下生成乳酸和NAD⁺，通過測定340nm?波長處NADH下降速率，得到丙酮酸含量。

優選地，，具體步驟如下：

????1）、配置相關試劑：

A、0.5mmol/L絲氨酸標準應用液，

B、R₁：20mmol/L?HEPES緩沖液，33?KU/L?LD，8.9KU/L?CBL，pH?7.4，

C、R₂：50mmol/L?Tris，0.416?mmol/L?NADH，pH?7.4；

????2）、根據自動化分析儀的型號、性能設定參數，溫度：37℃；波長：340nm；樣品和標準品各25μL，5s后加R₁100μL，10s后加R₂50μL，每隔28s檢測OD₃₄₀，分別測定樣品管和標準管吸光度的下降速率；

???3）、計算????????????????????????????????????????????????，?A_u是樣品管吸光度的下降速率，?A_s是標準管吸光度的下降速率。

本發明的有益效果

本發明是將絲氨酸樣品經過胱硫醚裂解酶作用后生成丙酮酸、氨和硫代半胱氨酸。通過乳酸脫氫酶法測定生成丙酮酸的含量，從而定量絲氨酸。本發明所提出的工藝操作簡便、快速，有較為精密和準確的分析性能、抗干擾能力強，能適應絕大多數自動生化分析儀，易于實現自動化，是目前測定絲氨酸的首選方法。

附圖說明

圖1為絲氨酸標準曲線。?

具體實施方式

下面結合實施例更具體地說明本發明的內容，應當理解，本發明的實施并不局限于下面的實施例，對本發明所做的任何形式上的變通都將落入本發明保護范圍。

在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為體積單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。若無特別指明，實施例采用的方法為本領域通用技術。