[發(fā)明專利]中國對蝦COMT重組蛋白的生產(chǎn)方法及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310591259.3
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103602642B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發(fā)明（設計）人: 李殿香;欒園園;王金星;趙小凡;王蕾;齊梅
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/81;A61K48/00;A61P31/04;A61P25/00;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 李茜

本發(fā)明屬于基因產(chǎn)品開發(fā)與應用領域，涉及中國對蝦COMT重組蛋白的生產(chǎn)方法及其應用。本發(fā)明的技術方案為：中國對蝦COMT重組蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：1）構建comt/pPIC9K重組表達載體；2）獲得轉(zhuǎn)化子高拷貝的畢赤酵母表達菌株comt/pPIC9K/KM71；3）轉(zhuǎn)化子的發(fā)酵培養(yǎng)與誘導表達；4）COMT純化。該法用真核????畢赤酵母生產(chǎn)與制備的兒茶酚?氧位?甲基轉(zhuǎn)移酶（COMT）有翻譯后的修飾，結(jié)構更天然，酶活性更高，直接用酵母液純化，省去了原核菌體回收、破碎的繁瑣步驟，降低了生產(chǎn)成本，提高了純化效率。

技術領域

本發(fā)明屬于基因產(chǎn)品開發(fā)與應用領域，涉及中國對蝦COMT重組蛋白的生產(chǎn)方法及其應用。

背景技術

兒茶酚-氧位-甲基轉(zhuǎn)移酶（Catechol-O-methyltransferase，簡稱COMT,E.C.2.1.1.6），是1958年首先在人體發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)甲基酶，主要代謝兒茶酚型的化合物，其反應機制如附圖1所示，COMT酶（E.C.2.1.1.6）在有二價鎂離子（Mg⁺⁺）存在時，催化S腺苷蛋氨酸(SAM)的一個甲基轉(zhuǎn)移到底物DHBAc分子的一個羥基上，形成甲基化產(chǎn)物香草酸（VA）和異香草酸(IVA)的反應機理。

在體內(nèi)，COMT 底物廣泛，包括兒茶酚胺、多巴胺、腎上腺素、二羥苯甲酸(DHBAc)等。在體外檢測時，底物DHBAc要比兒茶酚胺、多巴胺、腎上腺素相對穩(wěn)定。COMT可以將DHBAc甲基化，產(chǎn)生香草酸（VA）和異香草酸(IVA)。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術（HPLC-MS）是檢測COMT酶活性最為靈敏、快速的方法。

COMT在脊椎動物和無脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)，它不僅對生物的生長、發(fā)育有調(diào)控作用，而且與人類的精神疾病和腫瘤的發(fā)生有一定的聯(lián)系。據(jù)報道，人有COMT酶活性高、中、低三種多態(tài)：COMT低活性的人似乎與強迫癥、沖動好斗、燥狂抑郁等精神分裂癥以及帕金森病和乳腺癌等疾病的發(fā)生有關；而COMT高活性的人與神經(jīng)性厭食癥、吸毒和自殺有一定的聯(lián)系。顯然，COMT已經(jīng)成為一個有用的藥物發(fā)展的靶標。

2006年，我們首次克隆了中國對蝦（Fenneropenaeus chinensis）的COMT基因，公開了該基因編碼蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列（GenBank登錄號為DQ091255）。Northernblot和原位雜交顯示COMT基因在對蝦組織中廣為分布，在肝胰腺中高表達，在心臟和鰓中低表達，而且在細菌刺激的肝胰腺和胃中呈上調(diào)表達，說明中國對蝦COMT基因?qū)ξr可能有多種功能，尤其可能參與了對細菌感染的免疫反應。序列比對發(fā)現(xiàn)中國對蝦的COMT與人的COMT具有較高的的同源性，具體見論文 (Dian-Xiang Li, Xin-Jun Du, Xiao-FanZhao, Jin-Xing Wang. Cloning and expression analysis of an o-methyltransferase (OMT) gene from Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis.Fish & Shellfish Immunol. 2006;21:284–292. (SCI))。