[發明專利]中國對蝦COMT重組蛋白的生產方法及其應用

有效

• 申請號: 201310591259.3
• 申請日: 2013-12-13
• 公開（公告）號: CN103602642B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 李殿香;欒園園;王金星;趙小凡;王蕾;齊梅
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/81;A61K48/00;A61P31/04;A61P25/00;A61P35/00;C12R1/84
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 李茜

1.中國對蝦COMT重組蛋白的生產方法，其特征在于包括以下步驟：

1)構建comt/pPIC9K重組表達載體；

2)獲得轉化子高拷貝的畢赤酵母表達菌株comt/pPIC9K/KM71；

3)轉化子的發酵培養與誘導表達；

4)COMT純化；

所述步驟1)為采用鰻弧菌和金黃色葡萄球菌混合液誘導的中國對蝦cDNA為模板，合成包含EcoR I與Not I內切酶位點的正反向引物，

引物序列為：

COMT ExF：5’-TACTCAGAATTCATGTCTTCTCTGAAGAGTTAC-3’

COMT ExR：5’-TACTCAGCGGCCGC TCA ATG ATG ATG ATG ATG ATGTTTTTTAAAACAGAGAGACAAGC-3’

經聚合酶鏈式反應，擴增出666bp的COMT的ORF，將其克隆入pPIC9K質粒，構建comt/pPIC9K重組表達載體；

所述步驟2)為將構建好的comt/pPIC9K表達載體用Sal I酶切線性化，電轉化畢赤酵母(Pichia pastoris)KM71感受態細胞，線性化的載體將利用AOX基因同源重組到酵母的基因組中，通過篩選獲得高拷貝的表達菌株comt/pPIC9K/KM71；

所述步驟3)為將篩選出的高拷貝表達菌株comt/pPIC9K/KM71先接種到BMGY培養基上擴繁制種，再向發酵罐加入基礎鹽培養基滅菌，待其冷卻到30℃，攪拌通氣，調溶氧至100％，調pH至5.0，接5％的菌種，經適當提高轉速、通氣量，在30℃、pH5.0的條件下初始培養24h，間歇流加補料1，繼續培養12h后，再流加補料2誘導表達COMT酶蛋白；加補料2的流速開始為1mL/h/L，以后每30min提高10％，直到3mL/h/L并一直保持發酵到130h后結束；所述基礎鹽培養基、補料1和補料2的加入量體積比為8：1：1；

所述基礎鹽培養基為下述成份加去離子水至1L：質量濃度為85％的H₃PO₄：26.7ml、CaSO₄：0.93g、K₂SO₄：18.2g、MgSO₄·7H₂O：14.9g、KOH：4.13g、甘油：40g、微量鹽溶液：4.35ML；

所述補料1為下述成分加去離子水至1L：甘油：500g、微量鹽溶液：12ml；

所述補料2為：甲醇：1000ml、微量鹽溶液：12ml；

上述微量鹽溶液為下述成份加去離子水至1L，并過濾除菌：FeSO₄·7H₂O：65g、ZnCl₂：20g、CuSO₄·5H₂O：6g、MnSO₄·H₂O：3g、Co Cl₂·6H₂O：0.5g、Na₂MoO₄·2H₂O：0.2g、NaI：0.08g、H₃BO₃：0.02g、生物素：0.2g、H₂SO₄：5ml；

所述步驟4)為將酵母發酵液經12000rpm離心5min，讓上清液慢慢流經His-Bind親和層析柱，再用含咪唑的pH7.9的洗脫液把結合到柱子上的COMT酶蛋白洗脫下來，即獲得純的COMT酶蛋白，所述洗脫液的組成為：0.5M NaCl、20mM Tris-HCl和1M imidazole。