[發(fā)明專利]一種核酸適配體及其篩選方法、在檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞株中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310590626.8
• 申請(qǐng)日: 2013-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN103642810A
• 公開（公告）日: 2014-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高新;上官棣華;羅云;邴濤;王元元
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院;中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/115
• 分類號(hào): C12N15/115;C12N15/10;C12Q1/68;G01N15/14
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫

1.一種核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包含以下序列1、序列2、序列3中任意一條序列所示的DNA片段：

序列1：

5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGCTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’；

序列2：

5’-TGCCACTACAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3’；

序列3：

5’-TGCCACTAAGCTGGTTCGGTTTGGTGACTTCGTTCTTCGTTGTGGTGCTTAGTGGC-3’。

2.如權(quán)利要求1所述的核酸適配體，其特征在于：所述核酸適配體的核苷酸序列上的某一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。

3.如權(quán)利要求1或2所述的核酸適配體，其特征在于：所述核酸適配體的核苷酸序列上連接有熒光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、治療性物質(zhì)、生物素、地高辛、納米發(fā)光材料或酶標(biāo)記。

4.一種核酸適配體，其特征在于：所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下三種序列中的任意一種：

（1）與權(quán)利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列的同源性在60%以上；

（2）與權(quán)利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列進(jìn)行雜交的序列；

（3）權(quán)利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。

5.一種核酸適配體衍生物，其特征在于：所述衍生物是權(quán)利要求1或2或3中所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯骨架，或者是權(quán)利要求1或2或3中所述核酸適配體改造成的相應(yīng)肽核酸。

6.一種如權(quán)利要求1所述的核酸適配體的篩選方法，包括以下步驟：

（1）合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物：

隨機(jī)核酸文庫(kù)：

5-ACGCTCGGATGCCACTACAG-（45N）-CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’；

5’引物：5’-Fam-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3’；

3’引物：5’-Bio-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3’；

（2）核酸適配體篩選：將上述隨機(jī)核酸文庫(kù)與PC-3細(xì)胞株細(xì)胞孵育；孵育完成后，收集PC-3細(xì)胞株細(xì)胞；加熱變性分離結(jié)合在PC-3細(xì)胞株細(xì)胞的適配體，即為篩選所得的核酸適配體一級(jí)文庫(kù)；

（3）陰性篩選：將步驟（2）所得到的一級(jí)文庫(kù)與非靶細(xì)胞孵育，孵育完成后收集細(xì)胞孵育后的上清，即排除掉非特異性結(jié)合的核酸序列，得到富集的與靶細(xì)胞特異性結(jié)合的適配體組文庫(kù)；

（4）分別鑒定步驟（3）所得到的適配體組文庫(kù)各條序列的選擇性、親和力，最終得到核酸適配體。