[發明專利]新型合成的EBV共識DNA序列分子及由此組成的疫苗

有效

• 申請號: 201310588797.7
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103627714A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 林峰;吳炯
• 申請（專利權）人: 眾森源生物技術（江蘇）有限公司
• 主分類號: C12N15/38
• 分類號: C12N15/38;C12N15/85;A61K48/00;A61P31/22
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技術領域

本發明涉及基因工程技術和免疫學技術領域，尤其涉及到EBV病毒表達蛋白EBNA1、LMP1和LMP2的共識序列克隆、密碼子優化表達、以及注射并進入哺乳動物組織細胞內的免疫方法，以達到誘導機體免疫反應。產生細胞和體液免疫對抗EBV病毒感染或清除已感染的細胞或含EBV病毒蛋白的癌變細胞。?

背景技術

在發達國家Epstein-Barr病毒（EBV）引起超過90%的傳染性單核細胞增多癥（IM）。EBV通常通過口腔分泌物傳播，感染在咽喉部的B細胞，感染初期通常無癥狀或非特異性癥狀。然而，感染青少年或青年可導致IM，最新血清學研究顯示75%EBV陽性患者可導致IM。?

EBV感染與多種腫瘤有關。據統計，全世界每年約有84000例EBV相關的胃癌，78000例EBV相關的鼻咽癌，28000例EBV相關的霍杰金淋巴瘤（Fukayama?M.?Pathol?Int?60:337-50,?2010.?Parkin?DM.?Int?J?Cancer?118:3030-44,?2006)。在中國南部地區50歲男人患鼻咽癌的幾率是50/100,000?(de-The?G.?Epidemiology?and?control.?New?York:?Plenum?Medical?Book?Co.;?p.935-67,1997)，鼻咽癌在北非也很普遍。EBV也與其它腫瘤相關，比如鼻部NK/T細胞淋巴瘤和外周T細胞淋巴瘤。?

EBV與免疫抑制病人的多種腫瘤發生相關，在器官移植病人中EBV淋巴瘤是繼皮膚癌后最常見的腫瘤。?

EBV具有高度種屬特異性，僅感染人類。初步試驗研究發現狨猴也易于感染EBV患EBV淋巴瘤。以EBV主要糖蛋白gp350免疫狨猴可保護狨猴在EBV接種挑戰后不患EBV?B細胞淋巴瘤。?

EBV的gp350具有抗原性，可用來作為疫苗預防EBV感染和IM。EBV編碼多種蛋白質，這些蛋白質也可作為CD4和CD8?T細胞的靶標。目前仍不十分清楚哪幾種EBV病毒蛋白作為抗原（疫苗）可用來預防和治療EBV相關的腫瘤。在EBV相關的腫瘤中，可檢測到三種EBV蛋白質的表達，它們分別是EBNA1、LMP1和LMP2(Cohen?JI?et?al.?Sci?Transl?Med,?3:?107fs7,?2011)。最近研究證明，利用來源于這三種蛋白的不同多肽或多肽重疊作為抗原誘導動物產生免疫反應，從而篩選抗原簇用來作為鼻咽癌的免疫治療。?

基因(DNA)疫苗是一種新型疫苗，由含編碼病原體或癌癥抗原片段的質粒所組成，能使機體不但產生體液免疫(抗體)反應，而且能產生細胞(T細胞)免疫細胞，具有預防和治療效果。與傳統疫苗相比，DNA疫苗有如下優點：1)良好的安全性;?2)易于生產，大大縮短了生產時間和降低了生產成本;?3)優越的穩定性，易于分銷和長期貯存。目前有上百種DNA疫苗正在臨床試驗，比如宮頸癌DNA疫苗和通用大流感DNA疫苗均在臨床二期。?

DNA疫苗的關鍵是如何使DNA分子大量進入細胞內，從而表達抗原蛋白，誘導產生細胞和體液免疫反應。人們一直在尋找新的方法使其順利導入細胞。這些方法包括使用病毒或細菌載體、各種化學制劑如脂質體、物理方法如超聲、激光、和電脈沖導入等。以病毒或細菌作為載體的轉染導入方法，雖然效率高，?但會使機體產生對載體的免疫反應，從而使再次轉染導入降低。化學制劑脂質體的導入效率有限，超聲和激光方法，?目前仍然不夠成熟。體內電脈沖導入是目前使用較為廣泛的方法。?

發明內容

在EBV相關的腫瘤細胞中，可檢測到EBV的三種蛋白質：?EBNA1、LMP1和LMP2。來源于這三種蛋白的多肽或蛋白片段可誘導T細胞和B細胞免疫反應（Cohen?JI?et?al.?Sci?Transl?Med?3:107fs7,2011;?Li?W?et?al.?Protein?Pept?Lett?20:1136-43,2013;?Jones?K?et?al.?Blood?116:2245-52,2010)。本發明利用不同EBV病毒株的EBNA1、LMP1和LMP2蛋白質序列找出每一種蛋白質的共識序列作為抗原誘導抗體產生免疫反應來對抗來自不同EBV病毒株的感染或消滅不同EBV病毒株相關的腫瘤細胞。?