[發明專利]一種人羧酸酯酶CES2的高特異性熒光探針及其應用

有效

• 申請號: 201310587411.0
• 申請日: 2013-11-19
• 公開（公告）號: CN104650854A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 楊凌;馮磊;崔京南;葛廣波;劉兆明
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C07D311/30;C12Q1/44;G01N21/64;C12Q1/04
• 代理公司: 沈陽晨創科技專利代理有限責任公司 21001
• 代理人: 張晨

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種人羧酸酯酶CES2（Carboxylesterase2）的高特異性熒光探針及其應用。?

背景技術

羧酸酯酶（Carboxylesterase，CES）是機體內重要的一相水解代謝酶，催化多種內源性和外源性化合物發生酯鍵斷裂，釋放出極性的醇和羧酸分子片段，后者進而被體內CYP450或UGTs等其他代謝酶繼續催化代謝，使藥物分子更有效地被排出體外。多種結構中含有酯鍵的藥物分子，如鹽酸伊立替康（irinotecan，CPT-11）、奧司他韋（達菲）、氯吡格雷等均被羧酸酯酶催化進行活化或代謝消除。?

人體內介導藥物代謝的羧酸酯酶主要分布在2個家族：CES1和CES2，其中CES1又可繼續被分為CES1b和CES1c兩種亞型。CES1和CES2具有不同的組織分布特異性及底物選擇性，人的肝臟中主要分布表達CES1，同時表達一定量的CES2，而小腸中則基本以CES2亞型為主，只有極少量的CES1分布。近年來發現多種腫瘤細胞中CES2的表達水平上調，可借助此特征設計經CES2特異性水解的抗腫瘤前體藥物實現靶向選擇性殺傷腫瘤細胞的目的。此外，多數口服前藥需先經過腸道才能被吸收進入血液循環，因此腸道中CES2酶對酯類藥物的代謝被認為是其首過代謝的重要組成部分，CES2酶活的差異對于前體藥物的生物利用度具有十分重要的影響。此外，有些經靜脈給藥的前體藥物，如鹽酸伊立替康，會經過膽汁排泄被分?泌到腸道中，繼而被腸道中的CES2催化水解釋放出毒性代謝產物SN-38，后者被認為是導致伊立替康遲發型腹瀉副作用的主要原因。因而，建立基于探針的高通量技術手段，對于篩選CES2的高效抑制劑并將其應用于減緩伊立替康導致的遲發型腹瀉，以及對CES2功能的定量檢測都十分重要。?

本發明提供了一類3-羥基黃酮酯類衍生物及其作為CES2酶熒光探針底物的應用，其經羧酸酯酶CES2水解后可生成熒光發射波譜不同于原型的水解產物。該酶促反應具有選擇性高、代謝產物易檢測、酶活及抑制活性評價快速高效等特點。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種人羧酸酯酶CES2（Carboxylesterase2，CES2）的特異性熒光探針底物及其應用，該底物原型和水解產物的熒光發射波長具有明顯差異，且產物更易檢測。利用該探針反應可對多種生物體系中CES2的分布和功能進行定量評價。?

本發明提供了一種人羧酸酯酶CES2的高特異性熒光探針底物，該底物的酯鍵可被CES2特異性水解為相應水解產物并顯示與底物不同的發射波譜；?

該底物是以3-羥基黃酮類化合物為原料，通過酯化反應獲得相應3-羥基酯類衍生物，其結構通式如式（1）所示，其中，R為苯基、對甲基苯基、對乙基苯基、對丙基苯基、對己基丙基、對硝基苯基、對氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、4-乙氧基苯基取代基中的一種。?

如當R為4-乙基苯基時，該底物為3-羥基黃酮酯類衍生物。?

本發明還提供了所述人羧酸酯酶CES2的高特異性熒光探針底物的應用，該底物作為CES2的特異性底物，可利用其水解反應活性，通過定量檢測單位時間內水解產物的生成量來測定不同酶源中CES2的活性；具體測定方法為：?

——體系中以3-羥基黃酮酯類衍生物作為特異性探針底物；底物濃度選擇1/10～10K_m；單點測定時底物濃度優選K_m。?

——在PBS或Tris-HCl等常用緩沖液中，反應溫度為20℃至60℃之間，優選37℃為最優反應時間；孵育體系pH介于5.5～10.5之間，優選pH7.4為最優反應pH值；?

——反應時間為5～120分鐘，在確保以上底物相應的水解產物達到定量限且底物轉化率不超過20%時終止反應；?

——測定單位時間內水解產物生成量作為羧酸酯酶CES2活性的評價指標。?

本發明提供的人羧酸酯酶2的高特異性熒光探針底物的應用，所述酶源為重組表達的CES2單酶、人或動物組織制備液、或各類組織細胞生物樣品。?

本發明提供的人羧酸酯酶CES2的高特異性熒光探針底物的應用，所述?底物消除率或水解產物的生成率應介于0.1%～20%之間。?