[發明專利]環脂肽抗生素羅克霉素生物合成相關的基因簇

在審

• 申請號: 201310586700.9
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN104651380A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 羅楚平;郭俊堯;王曉宇;陳志誼
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12R1/125
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域：

本發明屬于微生物基因資源和基因工程領域，具體涉及具有廣譜抗菌活性，特別是抗病毒活性的環脂肽抗生素羅克霉素(locillomycin)的生物合成、分析、功能研究及應用。?

技術背景：

脂肽類抗生素是枯草芽孢桿菌及其相近物種通過非核糖體合成途徑合成的一類由親水性環狀短肽頭部和長鏈疏水性脂肪酸尾部組成的次生代謝產物，具有抗菌活性和溶血性能，在醫藥、農藥和工業上具有廣泛的應用價值。脂肽類抗生素根據其合成的基因簇和化學結構的差異可分為表面活性素(Surfactin)、伊枯草素(Iturin)和泛革素(Fengycin)三大家簇。?

表面活性素家簇結構的共同特點是由7個氨基酸殘基的多肽鏈通過酯鍵與含有13～15個碳原子β-羥基脂肪酸交聯形成內酯環狀結構的極性化合物。表面活性素通過作用于細胞膜的磷脂雙分子層而表現出較強溶血活性、抑制細菌和病毒的活性。該家簇主要包括枯草芽孢桿菌產生的表面活性素，短小芽孢桿菌產生的表面活性劑(Pumilacidin)，地衣芽孢桿菌產生的地衣芽孢桿菌素(lichenysin)。由于表面活性素7個氨基酸殘基的變異性較大，表現出很強的多樣性。?

伊枯草素家簇結構的共同特點是由7個氨基酸殘基的多肽鏈與含有14～17β-氨基脂肪酸鏈相連形成的化合物。伊枯草素也具有較強的溶血活性，主要是通過影響真菌細胞膜的表面張力，導致微孔的形成、促使電解質及其他重要離子的滲漏而表現出強的抗真菌活性。然而，伊枯草素對細菌和病毒的抑制活性較弱。伊枯草素家簇由枯草芽孢桿菌及其近源菌種合成分泌，主要包括9個異構體IturinA、C、D、E、Bacillomycin?D、F、L、Lc和Mycosubtilin。?

泛革素家簇結構的共同特點是由10個氨基酸殘基的多肽鏈通過酯鍵與含有14～18個β-羥基飽和或非飽和的脂肪酸交聯形成內酯環。泛革素的溶血作用沒有表面活性素和伊枯草素強烈，但表現出強烈的抗真菌活性和弱的抗細菌和病毒活性。泛革素也主要是由枯草芽孢桿菌及其相近菌種合成分泌，主要包括4中異構體Fengycin?A、B和Plipastatin?A、B。?

脂肽類化合物合成酶系NRPSs是目前所發現的最大的酶系之一，由多個模塊(Module)按一定的空間順序排列而成，一個典型的模塊大約有1000個氨基酸組成，主要負責一次底物縮合反應，負責將一個氨基酸整合到延伸的肽骨架上。每個模塊一般都含有氨基酸腺苷酰化(amino?acid?adenylation?domain，A)、肽酰載體蛋白(peptidyl?carrier?protein?doamin，PCP)、和縮合(condensation?domain，C)三個基本結構域。上述基本結構域將氨基酸整合?到肽骨架的具體過程是：1)A結構域從底物池中選擇結合特定的氨基酸，在ATP的作用下將底物活化；2)活化的底物，氨酰-AMP與PCP結構域上的輔因子磷酸泛酰巰基乙胺(4′-phosphopantetheine，Ppant)的巰基結合，形成氨酰-S-載體復合物；3)分別攜帶有氨酰基和肽酰基的載體與C結構域上的特定區域結合，形成新肽鍵，產生延長了一個氨基酸的新的肽鍵-S-載體復合物和游離的載體。在上述基本結構域的基礎上，有些模塊還存在一些修飾結構域，通常與基本結構域毗鄰，對氨基酸殘基進行進一步修飾。如，差向異構化結構域(Epimerization，E)催化L-型的氨基酸轉化為D-型氨基酸，甲基轉移酶結構域(methyltransferase?domain，M)。在合成酶系NRPSs的最后一個模塊包含一個硫酯酶結構域(Thioesterase?domain，TE)，該結構域負責脂肽類化合物的環化和從復合酶上的釋放。脂肽類的化合物的肽序列和催化模塊的排列之間存在線性關系，即模塊的數量、種類和排列的空間順序決定了相應脂肽類化合物肽序列的氨基酸殘個數、種類和順序。這種具有共線性結構域的NRPSs成為線性NRPSs(A型)。目前也發現一些偏離經典的共線性結構體系的NRPSs，如重復性NRPSs(B型)和非線性NRPSs(C型)。?