[發明專利]一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201310586576.6
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103570801A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 楊永新;趙小偉;程廣龍;黃冬維;趙輝玲
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;C07K1/28;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種動物組織蛋白的提取方法，具體是一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法。

背景技術

瘤胃是反芻動物特有的消化器官，是其進行微生物消化和物理消化的主要場所。瘤胃上皮的發育和功能完善直接影響到反芻動物的生產性能，并有“健康瘤胃，健康奶牛”的學術觀點。

瘤胃上皮由復層鱗狀上皮細胞組成，共分為四層，從漿膜層向粘膜層方向依次為：基底層、棘層、顆粒層和角質層。蛋白質組學研究技術的發展為深入了解瘤胃上皮組織在日糧營養物質消化吸收中發揮的作用提供了一種有力的研究工具。蛋白質組學是全面整體性的揭示一個生物樣本表達的全部蛋白質以及蛋白質間相互作用的科學領域。

雙向凝膠電泳因其能夠在凝膠中直觀的呈現一個復雜蛋白質混合物中每個蛋白質的等電點、分子量和相對表達量信息，以及蛋白質存在的翻譯后修飾。目前仍在蛋白質組研究中得到廣泛應用。

然而，因瘤胃上皮組織的復雜性，導致對于瘤胃上皮組織相關的蛋白質組研究相對滯后。蛋白質組學研究中蛋白質樣品的制備最為關鍵。適合雙向凝膠電泳分離的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法在瘤胃上皮功能研究中具有重要作用。

發明內容

針對現有技術中存在的技術問題，本發明提供了一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，該方法所提取的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白可采用二維凝膠電泳技術將總蛋白混合物依據蛋白質的等電點和分子量分離，同時獲取了蛋白質的相對豐度，可在凝膠圖譜中清楚直觀的呈現每個蛋白質的等電點、分子量以及相對表達量，具有比高效液相色譜分離方法、酶聯免疫法和免疫印跡等傳統技術更明顯的整體性和可視化的優勢。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案為：一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，包括如下步驟：

1)、將奶牛瘤胃上皮組織樣品置于預冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，將該組織粉末移至離心管中；

2)、在離心管中加入預冷的3～5倍組織粉末體積的10％三氯乙酸的丙酮溶液，振蕩渦旋混勻后-20℃放置過夜，離心棄去液相部分，收集沉淀A；

3)、向該組織沉淀A中加入其3～5倍體積的80％冷丙酮溶液，充分渦旋振蕩，-20℃放置0.5～2h，然后離心棄去液相部分，收集沉淀B；

4)、凍干該組織沉淀B，再加入等體積的裂解液，于4℃孵育并間隔渦旋20～40min，離心收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白。

優選的，所述的離心處理均是經10000×g離心15min。

優選的，所述步驟4)中的裂解液中含有8mol／L尿素、2mol／L硫脲、4％CHAPS、100mmol／L?Triton?X-100和65mmol／L二硫蘇糖醇。

一種如上述提取方法所提取的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應用，可采用二維凝膠電泳技術將總蛋白混合物依據蛋白質的等電點和分子量分離。

進一步的，具體包括如下步驟：

①、等電聚焦電泳分離

取580～620μg瘤胃上皮組織總蛋白樣品與水化上樣緩沖液混合均勻，使蛋白溶液的終體積為340～360μL；

離心并將蛋白溶液緩慢的加入到等電聚焦的電泳槽內，同時將預制的170mm?pH3-10膠條室溫放置5～15min，剝離膠條表明覆蓋的保護層，將膠條膠面朝下置入等電聚焦的電泳槽中，滴加礦物油后置于等電聚焦電泳儀中進行第一向等電聚焦；

②、膠條平衡

等電聚焦電泳結束后，用超純水反復沖洗膠條，用濾紙吸干，然后將膠條面朝上置于膠條平衡緩沖液I中，搖床輕微振蕩10～20min，然后置膠條于平衡緩沖液II中，搖床輕微振蕩10～20min，平衡結束后用超純水反復沖洗膠條，用濾紙吸干；

③、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

灌制12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠，室溫放置3～5h，將膠條支持膜貼在長玻璃板上，并置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，在凝膠上方加入0.5％的低熔點瓊脂糖溶液，輕推膠條使膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面緊密結合，且無氣泡；進行第二向電泳分離，起始電壓50V電泳0.5h，之后200V電泳至溴酚藍指示劑到達凝膠底部時停止電泳，切角標記；

④、凝膠染色及圖像掃描

聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后，將凝膠放置在含40％乙醇和10％乙酸的固定液中固定2.5～3.5h，用去離子水漂洗凝膠；將凝膠置于考馬斯亮藍G-250溶液中染色15～20h，凝膠用蒸餾水漂洗至背景清晰，再用掃描儀掃描。