[發明專利]一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法

有效

• 申請號: 201310586576.6
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103570801A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 楊永新;趙小偉;程廣龍;黃冬維;趙輝玲
• 申請（專利權）人: 安徽省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C07K1/30
• 分類號: C07K1/30;C07K1/28;C07K1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)、將奶牛瘤胃上皮組織樣品置于預冷的研缽中，添加液氮并研磨至粉末，將該組織粉末移至離心管中；

2)、在離心管中加入預冷的3～5倍組織粉末體積的10％三氯乙酸的丙酮溶液，振蕩渦旋混勻后-20℃放置過夜，離心棄去液相部分，收集沉淀A；

3)、向該組織沉淀A中加入其3～5倍體積的80％冷丙酮溶液，充分渦旋振蕩，-20℃放置0.5～2h，然后離心棄去液相部分，收集沉淀B；

4)、凍干該組織沉淀B，再加入等體積的裂解液，于4℃孵育并間隔渦旋20～40min，離心收集上清液，即奶牛瘤胃上皮組織總蛋白。

2.根據權利要求1所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，其特征在于，所述的離心處理均是經10000×g離心15min。

3.根據權利要求1所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的提取方法，其特征在于，所述步驟4)中的裂解液中含有8mol／L尿素、2mol／L硫脲、4％CHAPS、100mmol／L?Triton?X-100和65mmol／L二硫蘇糖醇。

4.一種如權利要求1或2或3所述提取方法所提取的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應用，其特征在于：可采用二維凝膠電泳技術將總蛋白混合物依據蛋白質的等電點和分子量分離。

5.根據權利要求4所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應用，其特征在于：具體包括如下步驟：

①、等電聚焦電泳分離

取580～620μg瘤胃上皮組織總蛋白樣品與水化上樣緩沖液混合均勻，使蛋白溶液的終體積為340～360μL；

離心并將蛋白溶液緩慢的加入到等電聚焦的電泳槽內，同時將預制的170mm?pH3-10膠條室溫放置5～15min，剝離膠條表明覆蓋的保護層，將膠條膠面朝下置入等電聚焦的電泳槽中，滴加礦物油后置于等電聚焦電泳儀中進行第一向等電聚焦；

②、膠條平衡

等電聚焦電泳結束后，用超純水反復沖洗膠條，用濾紙吸干，然后將膠條面朝上置于膠條平衡緩沖液I中，搖床輕微振蕩10～20min，然后置膠條于平衡緩沖液II中，搖床輕微振蕩10～20min，平衡結束后用超純水反復沖洗膠條，用濾紙吸干；

③、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離

灌制12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠，室溫放置3～5h，將膠條支持膜貼在長玻璃板上，并置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠上，在凝膠上方加入0.5％的低熔點瓊脂糖溶液，輕推膠條使膠條與聚丙烯酰胺凝膠膠面緊密結合，且無氣泡；進行第二向電泳分離，起始電壓50V電泳0.5h，之后200V電泳至溴酚藍指示劑到達凝膠底部時停止電泳，切角標記；

④、凝膠染色及圖像掃描

聚丙烯酰胺凝膠電泳結束后，將凝膠放置在含40％乙醇和10％乙酸的固定液中固定2.5～3.5h，用去離子水漂洗凝膠；將凝膠置于考馬斯亮藍G-250溶液中染色15～20h，凝膠用蒸餾水漂洗至背景清晰，再用掃描儀掃描。

6.根據權利要求5所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應用，其特征在于，所述水化上樣緩沖液中8mol／L尿素、2mol／L硫脲、4％CHAPS、65mmol／L二硫蘇糖醇、0.5％兩性電解質溶液和痕量溴酚藍。

7.根據權利要求5所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應用，其特征在于，所述等電聚焦電泳的條件為：水化和等電聚焦溫度均為20℃，主動水化12h，250V快速電泳1h、1000V線性電泳1h、9000V線性電泳5h，至電壓升至9000V時穩壓聚焦80000Vh。

8.根據權利要求5所述的奶牛瘤胃上皮組織總蛋白的應用，其特征在于，所述膠條平衡緩沖液I中含有6mol／L尿素、2％SDS、0.375mol／L?pH8.8Tris-HCl緩沖液、20％甘油和2.0％二硫蘇糖醇；所述膠條平衡緩沖液II中含有6m01／L尿素、2％SDS、0.375mol／LpH8.8Tris-HCl緩沖液、20％甘油和2.5％碘乙酰胺。