[發明專利]一種用于豹紋鰓棘鱸鑒別的引物對和探針、試劑盒及檢測方法

無效

• 申請號: 201310585155.1
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN103589802A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 陳雙雅;張永祥;李宏;王嘉鶴;陳偉玲;周昱
• 申請（專利權）人: 陳雙雅
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廈門市誠得知識產權代理事務所(普通合伙) 35209
• 代理人: 尤懷成

技術領域

本發明涉及海洋生物技術領域，尤其涉及用于豹紋鰓棘鱸鑒別的引物對和探針、試劑盒及實時熒光PCR檢測方法。

背景技術

物種鑒定是關系食品安全、質量、品質和營養等諸多方面的重要問題。物種來源不明的食品有可能因為含有過敏原成分和有毒成分而帶給消費者巨大的食品安全風險。另外，由于不同魚種的價值差異，用廉價魚種非法替代重要經濟價值魚種的現象越來越嚴重。一些不法商販頻頻通過錯誤標簽、以次充好和虛假標注等手段牟取暴利，損害消費者的利益和健康，使得魚類食品的質量安全問題逐漸凸現。歐洲委員會第104/2000條例和我國《預包裝食品標簽通則》都要求產品標識真實屬性的專用名稱，FDA“水產品危害及控制指南”第四版（2011）要求水產品標簽必須使用FDA可接受銷售魚種名錄中的名稱。因此，準確、快速地鑒別魚類物種顯得尤為重要。

魚類的物種鑒定，已從傳統的形態學方法發展到目前廣泛應用的分子生物學方法。傳統的形態學方法局限性多，對于加工過的魚片、魚糜產品并不適用。分子生物學技術以其簡便、快速的特點，發展迅速。其中，實時熒光PCR技術由于具有特異性高、不需要PCR產物后處理、有效解決了PCR污染問題、自動化程度高等優點，已成為國內外基因研究的熱點。

豹紋鰓棘鱸（Plectropomus?leopardus）又稱東星斑，屬于輻鰭魚綱鱸形目鱸亞目鮨科，分布于西太平洋區，包括日本南部、臺灣、澳大利亞、斐濟等海域，是名貴的海洋經濟魚類，在中國和世界的市場需求量很大，價格昂貴。近年來隨著人們生活水平的提高和需求的不斷變化，東星斑的消費發展極為迅猛，時有用低廉魚類冒充東星斑的現象發生，擾亂了東星斑的貿易市場。但是，國內外學者對豹紋鰓棘鱸進行物種DNA鑒定的研究很少，國內外尚未見報道能夠快速鑒別豹紋鰓棘鱸的方法。

因此，本領域急需一種快速、簡單、特異地鑒別豹紋鰓棘鱸的方法來增強名貴石斑魚市場的技術監管，保障水產品市場的規范秩序。

發明內容

本發明的目的在于提供一種能夠快速、準確且靈敏地進行豹紋鰓棘鱸鑒別的實時熒光PCR檢測試劑盒和檢測方法。

為實現上述目的，本發明提供一種用于實時熒光PCR方法鑒別豹紋鰓棘鱸的引物對和探針，其特征在于，所述引物對F289和R380，其序列分別為SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2所示的序列，所述探針P309的序列為SEQ?ID?No：3所示的序列，在探針序列的5’端連接有一個熒光報告基團FAM，3’端連接有一個熒光淬滅基團TAMRA。

一種用于實時熒光PCR方法鑒別豹紋鰓棘鱸的試劑盒，其特征在于：含有權利要求1所述引物對和探針的試劑盒。

所述引物對和探針、所述試劑盒用于鑒別豹紋鰓棘鱸的用途。

用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實時熒光PCR檢測方法，其中所述實時熒光PCR方法為Taqman熒光探針法，其特征在于：包括用權利要求1的引物對和探針，或者權利要求2試劑盒中的引物對和探針進行實時熒光PCR擴增的步驟。

所述引物對和探針用于豹紋鰓棘鱸鑒別的實時熒光PCR檢測方法，其特征在于：

從樣品中提取DNA為模板；

利用權利要求1的引物對和探針，或者權利要求2試劑盒中的引物對和探針，進行實時熒光PCR擴增；

對擴增曲線進行分析，并作出判斷。

所述的實時熒光PCR擴增反應體系為25?μL，即在0.2?mL的PCR反應管中加入12.5?μL?2×PCR?Taqman實時熒光PCR預混液，1?μL?10?μmol/L的上游引物F289，1?μL?10?μmol/L的下游引物R380，1?μL?10?μmol/L的探針P309，5?μL樣品基因組DNA，4.5?μL雙蒸水。?

所述的實時熒光PCR擴增反應條件為：95?℃?10?min；95?℃?15?s，64?℃?35?s，共35個循環。

所述的結果分析并作出判斷是樣品出現典型的特異性擴增曲線且Ct值小于35即判斷為檢出豹紋鰓棘鱸。

本發明引物對和探針是通過分析已報道的豹紋鰓棘鱸線粒體細胞色素氧化酶I亞基（cytochrome?oxidase?subunit?I，COI）基因序列設計。

本發明的引物對和探針根據豹紋鰓棘鱸COI基因序列（Genbank序列號JF750763）和其他石斑魚COI序列（Genbank序列號JF750758、JF750759、JF750760、JF750761、JF750762、JF750764、JF750765）設計得到。