[發明專利]質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法、試劑盒及其應用

無效

• 申請號: 201310585113.8
• 申請日: 2013-11-19
• 公開（公告）號: CN103602740A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 張學記;馬慶偉;張海燕;林燕
• 申請（專利權）人: 毅新興業（北京）科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 謝亮;趙德蘭

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法、試劑盒及其應用，具體而言是利用PCR技術、單堿基延伸技術和質譜技術，選用Kras基因對血清中游離DNA進行檢測的方法。

背景技術

游離循環核酸是一種存在于人的體液中的細胞外游離狀態核酸。游離循環DNA的分子大小在500bp～30kb之間。正常人外周血中游離DNA主要來自細胞核DNA和線粒體DNA，其含量較少，而腫瘤患者的外周血游離DNA主要來源于腫瘤細胞。

近年來，隨著對游離核酸研究的不斷深入，游離DNA的檢測已經在疾病監控、胎兒產前診斷和腫瘤研究中取得眾多進展。檢測惡性腫瘤患者血液中游離DNA用于基因診斷已成為研究熱點，且研究顯示血液中游離DNA有可能成為一種新的腫瘤診斷及預后判斷的標志物。游離DNA是存在于血液、滑膜液等體液中的細胞外游離DNA。研究發現許多腫瘤患者游離DNA與正常人相比有很大差異。游離DNA檢測避免了當前分子診斷需要采集癌組織作為標本來源的困難，是一種有潛力的腫瘤標志物。

近年研究發現在外周血液中能夠檢測到早期腫瘤細胞逸出的突變DNA，成為良好的腫瘤診斷、治療預后的生物標記。Kimura等（2006年）報道能夠在循環血液中檢測到Kras突變，認為檢測這些外周血液中的突變DNA，可以知道患者體內是否存在微小病灶、腫瘤手術后是否存在轉移、靶向藥物靶標位點的分子學特征等，從而作出相應治療方案。因此，檢測Kras基因的突變，還將有助于評價治療效果，有助于對腫瘤發病風險進行預測，有助于對腫瘤轉移進行早期診斷。

由于血液中游離DNA的含量很低，通常每毫升僅為納克水平，已經大大超出傳統的溴化乙啶染色和紫外分光光度儀等實驗室常用的DNA定量方法的檢測范圍。而熒光定量PCR方法涉及到熒光染料，容易引起假陽性。

申請號為200910177851.2的中國發明申請文件提供了一種檢測KRAS基因和/或BRAF基因的核苷酸突變位點的方法，該方法在一定程度上提高了檢測的靈敏度和準確度，但是其檢測速度仍不能滿足現狀的需求。所以本領域需要一種不僅具有高靈敏度和準確度，而且能真正提高速度的檢測游離DNA的方法。

發明內容

本發明提供一種高靈敏度、準確的檢測游離DNA的方法，以克服現有技術的不足。具體是一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，該方法的技術原理為：利用聯合PCR技術、單堿基延伸技術和質譜檢測技術，對血清中游離DNA進行檢測；其中：在單堿基延伸過程中，對PCR的純化產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在突變處分別延伸一個核苷酸，使得所延伸的核苷酸類型，分別與突變處的基因型相關；單堿基延伸產生由延伸引物和延伸產物組成的待檢混合物，以質譜對待檢混合物進行檢測，通過質譜峰確定待檢混合物中各物質分子量，并與預先計算的各延伸引物和延伸產物的理論分子量進行比對，從而確定待檢混合物是否包含特定的物質，進而確定各突變處的基因型。

本發明目的是提供一種質譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，包括如下步驟：

（1）PCR反應：游離DNA中Kras基因進行PCR擴增，得到含Kras基因12密碼子和13密碼子區域的PCR產物；所述PCR擴增是用序列為SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2的PCR引物進行擴增；

（2）PCR產物純化：對步驟（1）得到的PCR產物進行純化，以減少對后續反應的干擾；

（3）單堿基延伸：使用iPLEX?Pro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特異性的延伸引物，對步驟（2）得到的純化后PCR產物進行多重單堿基延伸，延伸引物在對應的SNP位點處延伸一個核苷酸，該核苷酸與SNP位點處的基因型互補配對；所述特異性的延伸引物為SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5中的任一條或幾條；

（4）延伸產物純化：對步驟（3）得到的延伸產物進行純化；以獲得高純的延伸產物，避免鹽離子等雜質對后續檢測的影響；

（5）質譜儀檢測：將步驟（4）得到的純化產物點在含有基質的靶片上，放入質譜儀進行檢測。