[發(fā)明專利]質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法、試劑盒及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310585113.8
• 申請(qǐng)日: 2013-11-19
• 公開（公告）號(hào): CN103602740A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張學(xué)記;馬慶偉;張海燕;林燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 毅新興業(yè)（北京）科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 北京馳納智財(cái)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11367
• 代理人: 謝亮;趙德蘭

1.一種質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，包括以下步驟：?

（1）PCR反應(yīng)：游離DNA中Kras基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含Kras基因12密碼子和13密碼子區(qū)域的PCR產(chǎn)物；所述PCR擴(kuò)增是用序列為SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2的PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增；

（2）PCR產(chǎn)物純化：對(duì)步驟（1）得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；

（3）單堿基延伸：使用iPLEX?Pro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特異性的延伸引物，對(duì)步驟（2）得到的純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行多重單堿基延伸，延伸引物在對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)核苷酸，該核苷酸與SNP位點(diǎn)處的基因型互補(bǔ)配對(duì)；所述特異性的延伸引物為SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5中的任一條或幾條；

（4）延伸產(chǎn)物純化：對(duì)步驟（3）得到的延伸產(chǎn)物進(jìn)行純化；

（5）質(zhì)譜儀檢測(cè)：將步驟（4）得到的純化產(chǎn)物點(diǎn)在含有基質(zhì)的靶片上，放入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.如權(quán)利要求1所述質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟（1）中所述Kras基因?yàn)?2S、12R、12C、12D、12A、12V、13D中的任一種或幾種，所述12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D基因序列分別為AGT-GGC、CGT-GGC、TGT-GGC、GAT-GGC、GCT-GGC、GTT-GGC、GGT-GAC。

3.如權(quán)利要求1所述質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟（1）中所述引物1和引物2的5'端都增加3-15個(gè)保護(hù)堿基序列。

4.如權(quán)利要求3所述質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，所述引物1和引物2的5'端都增加的保護(hù)堿基序列為：ACGTTGGATG。

5.如權(quán)利要求1所述質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟（1）中所述PCR擴(kuò)增是用dNTPs、MgCl₂進(jìn)行擴(kuò)增，所述dNTPs為dATP、dTTP、dGTP、dCTP。

6.如權(quán)利要求1所述質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟（1）中所述PCR擴(kuò)增是用Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增。

7.如權(quán)利要求1所述質(zhì)譜儀鑒定血清中游離DNA的方法，其特征在于，步驟（1）中所述PCR擴(kuò)增經(jīng)變性、退火、延伸三個(gè)步驟；所述變性溫度為95℃，所述退火溫度為56℃，所述延伸溫度為72℃。

8.一種鑒定血清中游離DNA的試劑盒，包括：

（1）PCR反應(yīng)試劑，包括：?PCR引物、耐高溫的DNA聚合酶、dNTPs、PCR反應(yīng)緩沖液、buffer；所述PCR引物為SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2；

（2）PCR產(chǎn)物純化試劑；

（3）單堿基延伸反應(yīng)試劑，包括：延伸引物、耐高溫的單堿基延伸酶、ddNTPs、延伸反應(yīng)緩沖液；所述耐高溫的單堿基延伸酶是iPLEX?Pro酶；所述延伸引物為SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5中的任一條或幾條。

9.如權(quán)利要求8所述的鑒定血清中游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述耐高溫的DNA聚合酶為Taq酶。

10.如權(quán)利要求8所述的鑒定血清中游離DNA的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)緩沖液為Tris-CL緩沖液。