[發(fā)明專利]成骨生長(zhǎng)肽碳端五肽的合成方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310578687.2
• 申請(qǐng)日: 2013-11-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103665109A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張騰;張忠旗;宋衛(wèi);馮凌云;楊小琳;趙金禮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西東大生化科技有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C07K7/06
• 分類號(hào): C07K7/06
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 申忠才

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及多肽的合成，尤其是短肽的液相合成。

背景技術(shù)

成骨生長(zhǎng)肽（Osteogenic?Growth?Peptide）是有促進(jìn)成骨和刺激造血作用的多肽類生長(zhǎng)因子，一級(jí)結(jié)構(gòu)為Ala-Leu-Lys-Arg-Gln-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly，其中碳端的五肽OGP（10～14）是保持成骨生長(zhǎng)肽全部活性的最小片段，氨基酸序列為NH₂-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH。

成骨生長(zhǎng)肽碳端五肽的制備方法有酶促合成法和固相合成法。其中固相合成法最為常用，即將保護(hù)甘氨酸接到固相載體上，按固定序列由碳端向氮端逐個(gè)延伸，通過(guò)縮合、脫除保護(hù)、再縮合、切割樹(shù)脂、離心、干燥得到粗品，經(jīng)高效液相制備得到純度高于90%的產(chǎn)品。該方法使用了保護(hù)的氨基酸，并需過(guò)量的原料和試劑，導(dǎo)致增加了生產(chǎn)成本，污染了環(huán)境，浪費(fèi)了原材料；且樹(shù)脂載體的交換當(dāng)量有限，只能進(jìn)行小批量合成，不能滿足實(shí)際生產(chǎn)需求。在成骨生長(zhǎng)肽碳端五肽的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，當(dāng)前需迫切解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供一種生產(chǎn)成本低、對(duì)環(huán)境污染少、收率高的合成方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述成骨生長(zhǎng)肽碳端五肽制備方法的缺點(diǎn)，提供一種生產(chǎn)成本低、對(duì)環(huán)境污染少、收率高的成骨生長(zhǎng)肽碳端五肽的合成方法。

解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：

由下述步驟組成：

1、合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu

將Fmoc-Tyr(tbu)-COOH置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-COOH加入10mL1,4-二氧六環(huán)，室溫?cái)嚢瑁尤氲u基丁二酰亞胺，再加入二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌至溶解，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-COOH與氮羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫反應(yīng)10～12小時(shí)，減壓過(guò)濾除去固體不溶物，濾液為溶有Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液。

2、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH

將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)5～8小時(shí)，減壓蒸除二氧六環(huán)，加1～5倍混合液體積的乙醚，攪拌，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的檸檬酸水溶液調(diào)pH至2～3，析出白色固體，減壓過(guò)濾收集白色固體，真空干燥箱內(nèi)40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH。

3、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化

將Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH加入10mL乙酸乙酯，室溫?cái)嚢瑁尤氲u基丁二酰亞胺或?qū)ο趸椒樱偌尤攵h(huán)己基碳二亞胺，攪拌至溶解，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-Gly-OH與氮羥基丁二酰亞胺或?qū)ο趸椒印⒍h(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫反應(yīng)12～15小時(shí)，減壓過(guò)濾除去固體不溶物，濾液減壓濃縮至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp。

4、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH

將步驟（3）所得的產(chǎn)物置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp加入10mL四氫呋喃，室溫?cái)嚢瑁镣耆芙狻?/p>

將0.5mM/mL的苯丙氨酸懸浮液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，苯丙氨酸與碳酸氫鈉、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的摩爾比為1.2～1.8：1.2～2：1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)8～10小時(shí)，減壓蒸除四氫呋喃，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%檸檬酸溶液調(diào)pH至2～3，有白色固體析出，減壓過(guò)濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空干燥箱內(nèi)40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH。

5、合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu