[發(fā)明專利]成骨生長肽碳端五肽的合成方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310578687.2
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103665109A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張騰;張忠旗;宋衛(wèi);馮凌云;楊小琳;趙金禮
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西東大生化科技有限責任公司
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責任公司 61201
• 代理人: 申忠才

1.一種成骨生長肽碳端五肽的合成方法，由下述步驟組成：

⑴合成Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu

將Fmoc-Tyr(tbu)-COOH置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-COOH加入10mL1,4-二氧六環(huán)，室溫攪拌，加入氮羥基丁二酰亞胺，再加入二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌至溶解，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-COOH與氮羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫反應(yīng)10～12小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液為溶有Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液；

⑵合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH

將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫攪拌反應(yīng)5～8小時，減壓蒸除二氧六環(huán)，加1～5倍混合液體積的乙醚，攪拌，用質(zhì)量分數(shù)為10%的檸檬酸水溶液調(diào)pH至2～3，析出白色固體，減壓過濾收集白色固體，真空干燥箱內(nèi)40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH；

⑶Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH活化

將Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-OH加入10mL乙酸乙酯，室溫攪拌，加入氮羥基丁二酰亞胺或?qū)ο趸椒?，再加入二環(huán)己基碳二亞胺，攪拌至溶解，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-Gly-OH與氮羥基丁二酰亞胺或?qū)ο趸椒?、二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫反應(yīng)12～15小時，減壓過濾除去固體不溶物，濾液減壓濃縮至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp；

⑷合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH

將步驟（3）所得的產(chǎn)物置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp加入10mL四氫呋喃，室溫攪拌，至完全溶解；

將0.5mM/mL的苯丙氨酸懸浮液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，苯丙氨酸與碳酸氫鈉、Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-COOSu或Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-ONp的摩爾比為1.2～1.8：1.2～2：1，室溫攪拌反應(yīng)8～10小時，減壓蒸除四氫呋喃，用質(zhì)量分數(shù)為10%檸檬酸溶液調(diào)pH至2～3，有白色固體析出，減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空干燥箱內(nèi)40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH；

⑸合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu

將Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-OH加入10mL1,4-二氧六環(huán)，采用步驟（1）的反應(yīng)條件進行化學反應(yīng)，得到溶有Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液；

⑹合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH

將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu的1,4-二氧六環(huán)溶液中，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-COOSu與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫攪拌反應(yīng)10～15小時，減壓蒸除二氧六環(huán)，用質(zhì)量分數(shù)為10%檸檬酸溶液調(diào)pH為2～3，加乙酸乙酯萃取，分離有機相，有機相依次用水、質(zhì)量濃度為26.5%氯化鈉水溶液洗滌，用無水硫酸鈉干燥、過濾、濾液減壓濃縮至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH粗品，用正己烷與乙醚體積比為1：3的混合液40KHz超聲洗滌三次，真空干燥箱內(nèi)40℃以下干燥，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH純品；

⑺合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp

將Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH加入15mL二氯甲烷，室溫攪拌，加入對硝基苯酚，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽，攪拌至溶解，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-OH與對硝基苯酚、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)-碳酰二亞胺鹽酸鹽的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫反應(yīng)15～17小時，水洗滌除去鹽，有機相減壓濃縮至干，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp；

⑻合成Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH

將步驟（7）所得的產(chǎn)物置于反應(yīng)瓶中，按每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp加入15mL四氫呋喃，室溫攪拌至完全溶解；

將0.5mM/mL的甘氨酸水溶液和0.5mM/mL的碳酸氫鈉水溶液等體積混合，混合液滴加到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp的四氫呋喃溶液中，F(xiàn)moc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-ONp與甘氨酸、碳酸氫鈉的摩爾比為1：1.2～1.8：1.2～2，室溫攪拌反應(yīng)10～15小時，減壓蒸除四氫呋喃，用質(zhì)量分數(shù)為10%檸檬酸溶液調(diào)pH至2～3，白色固體析出，減壓過濾，蒸餾水淋洗濾餅，真空干燥箱內(nèi)40℃以下干燥，得Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，柱色譜分離，用乙酸乙酯沖洗雜質(zhì)，再用甲醇與乙酸乙酯體積比為1：3的混合液沖洗目標物，收集，減壓蒸干，得到Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH純品；

⑼合成NH₂-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH

在每克Fmoc-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mL哌啶與1,4-二氧六環(huán)體積比為1：9的混合液，室溫反應(yīng)30分鐘，減壓蒸干，用水溶解，用二氯甲烷萃除雜質(zhì)，水相減壓濃縮至干，得NH₂-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH；

⑽合成NH₂-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH

在每克NH₂-Tyr(tbu)-Gly-Phe-Gly-Gly-OH中加入10mL體積分數(shù)為95%的三氟乙酸水溶液，室溫反應(yīng)10分鐘，減壓濃縮，加濃縮體積7倍量的冷凍乙醚，攪拌，離心，分離出上清液，固體經(jīng)真空干燥箱內(nèi)40℃以下干燥，得NH₂-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH粗品，經(jīng)反相色譜法純化、濃縮、凍干得純度大于93%的序列為NH₂-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly-OH的成骨生長肽碳端五肽。